IL-1β誘導(dǎo)肝細(xì)胞核受體RXRα核-胞漿轉(zhuǎn)移與泛素連接酶GP78表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　目前認(rèn)為多種肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常在膽汁淤積的分子病理機(jī)制中起到關(guān)鍵作用,而核受體維甲酸類X受體α(RXRα)則在膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄水平起到核心調(diào)控作用。RXRα作為核受體蛋白超家族的成員,可以與多種核受體形成異源二聚體從而廣泛參與多種靶基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。目前研究證明在炎性因子的刺激下RXRa參與了多種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控,如NTCP、BSEP、MRP2及MRP3等,在膽汁淤積時(shí)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。不同細(xì)胞在L

2、PS及9cisRA的作用下,RXRα可以發(fā)生核-胞漿轉(zhuǎn)移,從而發(fā)揮其各種生物學(xué)功能。細(xì)胞內(nèi)RXRα的表達(dá)降低,被認(rèn)為可能與泛素-蛋白酶體降解途徑(ERAD)介導(dǎo)的RXRα蛋白降解相關(guān)。ERAD能夠識(shí)別天然的或錯(cuò)誤折疊的蛋白或多肽,并高度選擇性的進(jìn)行降解,并參與某些重要蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和改造,從而在多種生理過程中發(fā)揮作用。而泛素連接酶(E3)作為蛋白酶體降解途徑中關(guān)鍵性調(diào)節(jié)介質(zhì),可能在RXRα蛋白的降解中起到重要的作用。由于膽汁淤積導(dǎo)致

3、肝內(nèi)毒性膽汁酸蓄積進(jìn)而引起肝細(xì)胞炎性反應(yīng)和損傷,在這個(gè)過程中炎性細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用。在LPS誘導(dǎo)和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝臟膽汁淤積中,IL-1β及TNFα的基因及蛋白水平表達(dá)均明顯升高。我們選擇了細(xì)胞因子IL-1β處理人肝癌HepG2細(xì)胞后觀察RXRα的表達(dá)及亞細(xì)胞定位變化,并對RXRα的降解過程中相關(guān)E3進(jìn)行初步探索研究,旨在研究RXRα在膽汁淤積中作用的分子機(jī)制及生物學(xué)意義,對揭示膽汁淤積發(fā)病機(jī)理及尋找有效的治療措施提供線索。

4、r>　　研究方法:
　　1.IL-1β體外刺激HepG2細(xì)胞,RT-PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞內(nèi)RXRα基因mRNA表達(dá)的變化;Western Blot檢測IL-1β對細(xì)胞RXRα總蛋白、核蛋白及胞漿蛋白表達(dá)的影響。運(yùn)用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理細(xì)胞后再用IL-1β體外刺激HepG2細(xì)胞,Western Blot檢測IL-1β對細(xì)胞RXRα蛋白表達(dá)的影響。
　　2.IL-1β體外刺激HepG2細(xì)胞,Western

5、 Blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β對細(xì)胞泛素連接酶GP78、TEB4、HRD1蛋白表達(dá)的影響。
　　3.收集人體正常(n=12)及膽汁淤積(n=12)肝臟組織樣本,WesternBlot檢測肝組織中泛素連接酶GP78、TEB4、HRD1蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),IL-1β誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞RXRα總蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),胞核、胞漿RXRα蛋白的變化符合RXRα胞

6、核-胞漿轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的表現(xiàn)。
　　2.MG132預(yù)處理細(xì)胞后,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞RXRα胞核、胞漿蛋白表達(dá)改變被抑制,RXRα胞核-胞漿轉(zhuǎn)移現(xiàn)象可能被MG132抑制。
　　3.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),IL-1β誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞gp78蛋白表達(dá)增高(P<0.05),而TEB4、HRD1蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　4.Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),人體淤膽肝組織中GP7