大鼠肝細胞核的肝再生相關蛋白鑒定與作用分析.pdf

1、肝臟具有很強的再生能力，大鼠部分肝切除（paritalhepatectomy，PH）作為刺激信號，通過多種途徑激活信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應，促進殘肝細胞進入細胞周期循環(huán)，補償丟失的肝臟細胞并恢復肝臟的生理功能，這個過程涉及包括核蛋白在內(nèi)的多種功能蛋白參與。細胞核是遺傳和代謝的調(diào)控中心，核內(nèi)含有較多的功能蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)組學水平研究它們與大鼠肝再生中的相關性有助于揭示肝再生的分子機制。
　　 為此，本研究首先用兩步灌流結(jié)合Percoll密

2、度梯度離心分離純化大鼠肝細胞，用蔗糖密度梯度離心得到純的肝細胞核，提取細胞核蛋白進行雙向電泳(2D)結(jié)合灰度掃描進行定量分析，用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜進行定性分析。在大鼠肝細胞核中鑒定出了204種核蛋白，包括持家蛋白、低峰度的轉(zhuǎn)錄因子、信號應答分子等。本研究進而制備了大鼠2/3部分肝切除模型，并分別在肝再生的0h、2h、6h、12h、24h、30h、36h、72h、120h、168h取材;采用上述策略構(gòu)建肝再生(liverrege

3、neration，LR)進程中核蛋白的表達譜，以相對0h表達變化2倍為界限，確定大鼠肝再生的相關核蛋白，用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定其具體成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，62種蛋白在肝再生進程中發(fā)生了有意義表達變化，其中49種表達上調(diào)，12種蛋白表達下調(diào)，1種蛋白表達上下調(diào)。結(jié)合本實驗室研究得到的大鼠肝再生相關基因表達譜芯片數(shù)據(jù)，分析基因水平和蛋白水平表達的差異，確定了40種大鼠肝再生相關核蛋白，然后將這些核蛋白表達譜數(shù)據(jù)輸入信號通路分析系統(tǒng)(I

4、ngenuityPathwayAnalysis，IPA)進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述肝再生相關核蛋白的作用包括以下幾方面:
　　 （一）DNA損傷修復與復制起始:聚合酶POLD表達上調(diào)，與增殖細胞核抗原(PCNA)和復制因子C(RFC)等輔助蛋白一起起始前導鏈的合成，同時參與DNA聚合酶α/引物酶復合物引發(fā)的岡崎片段合成;解旋酶WRN表達上調(diào)，促進DNA復制、修復和重組;DNA引物酶PRIM1表達上調(diào)，促進細胞DNA復制;DNA損傷

5、誘導表達蛋白GADD45A表達上調(diào)，通過p38MAPK、mTOR/STAT3信號通路促進DNA修復和細胞分裂G2/M轉(zhuǎn)換。
　　 （二）促進細胞分裂相關蛋白啟動:剪接因子SRSF2、SRSF5、SFPQ表達上調(diào)加速相關PH誘導mRNA的加工，為順利啟動肝再牛提供后勤保障:CENPW在PH后迅速積累表明肝細胞由靜止狀態(tài)向分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)變，增殖行為迅速活躍;核纖層蛋白LMNB1、LMNB2的積累導致核膜崩解，促進細胞進入有絲分裂中期;轉(zhuǎn)

6、錄調(diào)節(jié)因子NPM1和SRSF2激活TP53，參與細胞內(nèi)核糖體合成、中心體復制、蛋白質(zhì)折疊、組蛋白裝配、細胞增殖、DNA損傷修復、細胞凋亡等生理活動的調(diào)節(jié);周期蛋白CCNC調(diào)控CDK2的活性，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子BARD1，進而激活NPM1活性，通過MMP8清除細胞外多余基質(zhì)、促進細胞分裂;通過HOXA7、HOXA8、HOXA10抑制細胞分化，掃清細胞分裂的障礙。
　　 （三）抗炎癥抗凋亡相關蛋白表達:硫氧還蛋白TXN表達上調(diào)，相應細胞

7、內(nèi)各種氧化還原反應，誘導FOS/JUN的AP-lDNA結(jié)合活性，促進下游相關基因的轉(zhuǎn)錄，誘導白細胞介素2(IL-2)受體TAC的表達，抑制細胞炎癥反應;蛋白激酶C亞基PRKCD表達上調(diào)，磷酸化激活下游底物p53/TP53，激活死亡促進轉(zhuǎn)錄因子BCLAF1/Btf,觸發(fā)BCLAF1-介導的p53/TP53信號通路基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗凋亡作用;PRKCD誘導細胞周期蛋白D1(CCND1)和RB1的過度磷酸化，并通過NF-KB，AKT1和MAPK

8、1/3(ERK1/2)等途徑促進細胞的存活和抵抗化療藥物。
　　 （四）細胞生長因子分泌和肝功能恢復:蛋白激酶MAPK9表達上調(diào)磷酸化調(diào)節(jié)MYC的活性，促進DNA合成和損傷修復，促進細胞分裂，加速細胞合成IL-6;轉(zhuǎn)錄因子GATA4表達上調(diào)，激活BMP、經(jīng)典的wnt受體信號通路的作用，促進肝臟功能恢復:鈣結(jié)合蛋白SIOOA4表達上調(diào)，激活I-KB激酶/NF-KB信號級聯(lián)，抑制細胞外基質(zhì)產(chǎn)量，促進再生;TGFβ-1誘導蛋白TGFβ

9、111表達下調(diào)，通過Wnt、TGFB和整合素信號通路活性，調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素、雄激素、鹽皮質(zhì)激素和孕激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、遷移、分化和衰老。
　　 綜上所述，上述肝再生相關蛋白激活基質(zhì)重塑和傷口愈合，參與再生肝中肝細胞生長因子(HGF)的生產(chǎn)，進而誘導細胞迅速進入細胞周期而增殖。同時，加速合成去甲腎上腺素、IL-6、TNFα、TGFβ、透明質(zhì)酸等各種激素和信號分子，激活AP1、NF-kB、STAT3、Notch、F