鯊魚肝臟中與肝再生相關(guān)的microRNAs研究.pdf

1、條紋斑竹鯊，俗稱狗鯊，屬于軟骨魚類，在我國分布于南海、臺灣海峽和東海等海區(qū)，是南海最有代表性的軟骨魚類之一。鯊魚肝臟占據(jù)內(nèi)臟重量的75％，研究表明，其具有較強的肝臟再生能力，體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，許多研究者已從條紋斑竹鯊中分離克隆了多種與肝再生和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的刺激因子，但尚未有關(guān)其肝臟相關(guān)miRNA報道。近年研究表明，miRNA在動物肝臟中含量豐富，在肝臟發(fā)育、癌變、再生階段發(fā)揮重要作用，因此，開展條紋斑竹鯊肝臟中與肝再生相關(guān)的mi

2、RNA研究，鑒定與肝再生相關(guān)功能基因，將加深動物的肝再生機理認識，并且對推動肝類疾病及海洋生物學的研究工作具有積極意義。
　　 本研究通過條紋斑竹鯊肝臟2/3部分切除模型建立，獲得正常、再生6h、再生12h和再生24h肝組織;將正常和再生24h肝組織進行miRNAIllumina測序，所得序列通過與斑馬魚(Danio rerio)、紅鰭東方鲀（Fugu rubripes）、青鳉（Oryzias latipes）、光滑爪蟾(Xen

3、opus laevis)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、人（Homo sapiens）和小鼠(Mus musculus)的miRNA、miRNA前體序列(pre-miRNA)及米氏葉吻銀蛟（Callorhinchus milii）基因組序列進行比對，首次鑒定出條紋斑竹鯊257條miRNA，包括91條已知miRNA和166條非保守的PC(Predicted Candidate)miRNA，其中正常肝組織135條PCmi

4、RNA，再生24h肝組織117條PCmiRNA，并且31條PCmiRNA只在再生24h肝組織檢測到，49條PCmiRNA只在正常肝組織檢測到;這些miRNA隸屬于34個基因簇，其中16個基因簇分別由16個共同的前體生成，每個前體生成2條miRNA;統(tǒng)計出已知miRNA在正常和再生24h肝組織中平均reads分別為8173和8972，PCmiRNA平均reads分別為1687和1781，但128條PCmiRNAreads＜10，116條m

5、iRNA在再生24h肝組織和正常肝組織中的log2reads比值大于1，但其中只有5條miRNAreads＞10，且只有8條為已知miRNA;對91條已知miRNA采用miRandav1.0b軟件進行靶基因預(yù)測，86條miRNA可預(yù)測到靶基因，57條miRNA在其靶基因上有多個靶位點，共14163個靶位點;將這些候選靶基因進行GO分析，可映射到38個class，其中“cell proliferation”和“growth”條目各有5條靶

6、基因，相關(guān)的miRNA46條。
　　 通過RT-PCR驗證7條目標miRNA于正常肝組織都有較高表達，并通過real-timePCR分析其中3條與細胞增殖及凋亡相關(guān)的miRNA（xtr-miR-125b、fru-miR-204a、hsa-miR-142-3p_R-1）在正常、再生6h、再生12h和再生24h肝組織4個時間點的差異表達情況，得知3條miRNA在四個不同時間的轉(zhuǎn)錄情況存在較大差異，在肝再生6h、12h時表達顯著上調(diào)，

7、在24h時表達下降趨向于正常水平。為深入全面了解鯊魚肝再生與miRNA的關(guān)系，本研究還完成了6h和12h再生肝組織小RNA庫的構(gòu)建及測序，后期將繼續(xù)進行miRNA的信息分析及差異驗證工作。
　　 本研究還采用20條10堿基隨機引物和2條錨定引物對正常和再生24h肝組織通過DDRT-PCR方法進行差異表達基因的篩選，獲得10條差異序列;通過Blast檢測到其中3條與NCBIESTlibrary的序列有較高相似性，5條序列在再生肝組