條紋斑竹鯊再生肝臟中差異RNA的研究.pdf

1、條紋斑竹鯊，是一種比較有代表性的軟骨魚類，其肝臟比重占到內(nèi)臟比重的3/4的。據(jù)研究報道，鯊魚肝臟體內(nèi)含有許多生物活性物質(zhì)，包括了多種肝再生相關(guān)的刺激因子，但沒有肝臟microRNA的相關(guān)報道。由于micro RNA和基因組信息的缺乏，也影響了對鯊魚肝再生調(diào)節(jié)的分子機制的深入研究。
　　本研究構(gòu)建了條紋斑竹鯊1/3肝切除模型，提取正常和再生3h肝組織的RNA，應(yīng)用Illumina測序平臺對條紋斑竹鯊正常和再生肝臟進行microRNA

2、測序以及轉(zhuǎn)錄組測序，通過microRNA測序，鑒定出670條microRN As(290條knownmicroRNAs和380條PC microRNAs)，這些micro RNA隸屬于145個基因簇;通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得339998條Unigenes，其中有60047條Unigenes，能注釋到基因信息。對測序結(jié)果進行初步分析，主要篩選肝再生過程中差異表達的基因和microRNAs，進一步闡釋肝再生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要篩選依據(jù)是正常和再生3h

3、肝組織中microRNA和Unigene的Fold Change的比值，共篩選到119條差異表達的microRNAs以及4754個差異表達的Unigenes。一方面以注釋上基因信息的Unigenes作為靶基因庫，利用miRanda和Targetscan對119條差異microRNAs進行靶基因預測，將這些候選靶基因進行GO功能以及KEGG富集分析，以P＜0.01為閾值，篩選顯著富集的GO注釋以及信號通路，其中GO注釋可映射到28個cla

4、sses，其中包含了“cell division”、“cell cycle”以及“G2/Mtransition of mitotic cell cycle”;篩選出來8條顯著富集的信號通路，其中包含了“Cell Cycle”和“JAK-STAT signaling pathway”。另一方面通過Real-Time PCR分析microRNA以Unigene在正常和再生3h肝組織中差異表達情況，驗證了5條microRNAs以及3條Unig

5、enes在正常和再生3h肝組織中具有2倍以上的差異。其中包括4條上調(diào)microRNAs和1條下調(diào)microRNA以及3條下調(diào)Unigenes（ICA、GSTP1和PDRX5）。然后通過靶基因預測軟件分析驗證具有差異表達的microRNAs和Unigenes的靶向性，發(fā)現(xiàn)其中3條microRNAs(PC-5p-13888_168、xtr-miR-34b_L-1 R+1和tni-miR-144)和3條Unigenes（1CA、GSTP1和P

6、DRX5）具有靶向作用，進一步通過雙熒光素酶報告法驗證，將ICA、GSTP1和PDRX5的3'UTR全長序列以突變及種子序列結(jié)合位點的3'UTR插入到psiCHECK2載體中，通過與對應(yīng)的micro RNA mimics，轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細胞，根據(jù)海腎熒光素酶的表達活性，找出PC-5p-13888_168、 xtr-miR-34b_L-1R+1和tni-miR-144的靶基因。通過SPSS軟件分析，結(jié)果顯示xtr-miR-34b_