半夏高溫倒苗過程中總RNA及基因差異表達(dá)片段的研究.pdf

1、半夏Pinelliaternata(Thunb.)Briet.為天南星科半夏屬多年生宿根草本植物，以塊莖入藥，是一種重要的中藥材。在氣溫高于26℃，半夏地上部分隨即枯萎，俗稱“倒苗”。在實際生產(chǎn)中高溫引起的半夏倒苗會直接導(dǎo)致其產(chǎn)量的降低。而半夏高溫倒苗的機理還不清楚。為了給研究半夏高溫倒苗的機理提供基礎(chǔ)，本研究建立了一種經(jīng)濟(jì)、簡單、高效的半夏高質(zhì)量總RNA提取技術(shù)，通過DDRT-PCR技術(shù)及基因序列分析軟件，對高溫脅迫倒苗過程中的半夏總

2、RNA含量變化與基因差異表達(dá)片段進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果如下： 1.對異硫氰酸胍法、皂土法、CTAB-LiCl法和SDS/酚法四種改進(jìn)的RNA抽提方法提取結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，皂土法的提取過程只需3～4小時，是其它3種提取方法所用時間的一半。提取1克葉片的成本只有其它3種方法的1/13～1/14。此法提取的總RNA18S、28S帶型清晰無彌散，完整性好，無蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染，OD260/OD280介于1.8～2.0之間，O

3、D260/OD230大于2.0，且總RNA的產(chǎn)率高，為.365.744μg/g鮮重，提取的總RNA適用于RT-PCR試驗，可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究，是一種快速、經(jīng)濟(jì)，適于抽提半夏總RNA的好方法。 2.以經(jīng)過高溫脅迫處理不同時間的半夏葉片為材料，通過測定總RNA含量變化和基因差異表達(dá)顯示技術(shù)，分析了半夏高溫倒苗過程中總RNA及基因差異表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，總RNA的含量變化分為三個降低階段和兩個升高階段，脅迫0h和6h時含量

4、最高，脅迫4h、42h和倒苗時含量最低，差異顯示表明脅迫6h的樣品條帶多態(tài)性和帶型與0h的接近，其余脅迫時間的樣品條帶遠(yuǎn)少于0h和6h時的樣品的條帶，并且在不同的樣品之間均有差異條帶出現(xiàn)。這說明在半夏經(jīng)高溫脅迫而倒苗的過程中，其基因表達(dá)開啟與關(guān)閉和基因表達(dá)增強與減弱模式具有一定的規(guī)律，并且可能啟動了不同的基因表達(dá)系統(tǒng)，從而為研究半夏高溫倒苗的分子機理提供了信息。 3.利用DDRT-PCR共分離出33個差異片斷，選擇其中的18個片

5、斷，通過對序列同源性分析及陽性鑒定，共得到7個陽性片斷，其中3個(片斷5、11、17)搜索到同源序列，4個(片段4、7、12、13)未搜尋到同源序列。因為目前國內(nèi)外對半夏相關(guān)基因的研究還是很少，未搜尋到同源序列的原因可能有兩種：一種是這些獲得的特異片段只是一些基因的3'末端，而基因的5'和3'末端非翻譯區(qū)同源性很??；另一種就是這些片段代表了一些特異的新基因，還有待于進(jìn)一步的研究。而搜索到同源序列的兩個片斷分別是對核酸合成有作用的核酮糖磷