腸道菌群與肝臟切除術(shù)后肝臟再生代謝通路的相關(guān)性研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 肝臟部分切除術(shù)后肝臟損傷修復(fù)不同病理階段的界定
　　目的：肝臟具備強(qiáng)大的再生能力，能在遭受炎癥或外科手段打擊下，通過(guò)肝細(xì)胞的代償性肥大或增殖來(lái)修復(fù)正常的體積和功能。大部分肝臟切除術(shù)所構(gòu)建的肝臟再生往往伴隨著不同程度的炎癥損傷，使我們?cè)跈C(jī)制研究中難以判別所研究參數(shù)是起有害或有利于再生的作用，因此明確區(qū)分界定肝臟再生過(guò)程的不同生理階段，將為后續(xù)的研究奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法：

2、本研究采用70％大部分肝臟切除手術(shù)(partial hepatectomy, PH)構(gòu)建肝臟再生模型。126只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三個(gè)大組:正常對(duì)照組(n=6)，假手術(shù)組(n=60)和肝臟切除組(n=60)。其中假手術(shù)組和肝臟切除組分別根據(jù)大鼠處死時(shí)間分成十個(gè)亞組:12、18、24、30、36、48、72小時(shí)、7天、10天和14天。采集下腔靜脈血用于生化指標(biāo)檢測(cè)，肝組織用作病理學(xué)、免疫組化和細(xì)胞因子mRNA(腫瘤壞死因子-α(TNF-α

3、)、白介素6(IL-6)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β))檢測(cè)。
　　結(jié)果：血液中肝臟生化功能指標(biāo)（ALT、AST和膽紅素）在術(shù)后24小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰，術(shù)后72小時(shí)恢復(fù)正常水平;同樣，肝臟病理學(xué)鏡檢結(jié)果和炎癥評(píng)分也顯示肝臟炎癥損傷在術(shù)后24小時(shí)最嚴(yán)重。5-BrdU和Ki-67陽(yáng)性的肝細(xì)胞比例反映了進(jìn)入細(xì)胞周期S期和活躍期的細(xì)胞比重，免疫組化染色結(jié)果顯示肝細(xì)胞再生活動(dòng)在術(shù)后30小時(shí)明顯增加，至48小時(shí)進(jìn)入S期

4、的肝細(xì)胞比例最高。肝內(nèi)各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)在術(shù)后迅速上調(diào)，并分別于24小時(shí)（TNF-α和IL-6、），18小時(shí)(HGF)和72小時(shí)(TGF-β)達(dá)到最高水平。
　　結(jié)論：根據(jù)PH術(shù)后炎癥和再生指標(biāo)的不同表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中我們可以把肝臟再生分成以下三個(gè)階段:啟動(dòng)期（12-24小時(shí)）、增殖期（30-48小時(shí)）和終止期(3-14天)。
　　第二部分 肝臟再生過(guò)程腸道菌群結(jié)構(gòu)變遷
　　目的：腸道菌群及其代謝物質(zhì)通過(guò)肝-腸軸與肝臟

5、在解剖及功能上密切相關(guān)，已經(jīng)腸道細(xì)菌在肝臟再生過(guò)程中扮演重要角色，然而腸道微生物群落中影響肝臟再生的關(guān)鍵功能菌迄今為止沒(méi)有深入研究過(guò)。
　　方法：本研究采用MiSeq2000測(cè)序技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)來(lái)自肝臟切除大鼠的糞便樣品腸道細(xì)菌多樣性及其組成進(jìn)行了詳盡的分析，并且在PICRUSt工具（通過(guò)隱性狀態(tài)重建群落系統(tǒng)進(jìn)化的研究）的幫助下，發(fā)掘腸道細(xì)菌功能基因的變化。
　　結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)PH大鼠腸道細(xì)菌多樣性與正常組無(wú)明顯

6、差異。對(duì)腸道細(xì)菌多樣性組成的整體結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行主坐標(biāo)分析和非線性多維度分析，顯示不僅是PH組與正常組存在明顯的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異，不同時(shí)間點(diǎn)的PHx組間也發(fā)生了菌群構(gòu)成的變遷。在門(mén)的水平上，與正常對(duì)照組相比，PHx糞便內(nèi)容物中厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度均發(fā)生了明顯改變。在再生早期（12-24小時(shí)），厚壁菌門(mén)相對(duì)含量明顯升高，隨著肝細(xì)胞再生的活躍，其豐度逐漸下降，48小時(shí)降至最低水平，令人意外的是，厚壁菌門(mén)在術(shù)后的3-14天并未恢復(fù)正常

7、水平，而是維持較高的相對(duì)含量。而擬桿菌門(mén)則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。相對(duì)應(yīng)的是，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值也經(jīng)歷了降低-升高-降低的波動(dòng)過(guò)程，提示腸道菌群在肝臟再生過(guò)程中不斷調(diào)整結(jié)構(gòu)，改變能量攝取效率。厚壁菌門(mén)的改變歸因于Ruminococcaceae和Lachnospiraceae，而擬桿菌門(mén)的變化主要由Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Rikenellaceae和Porphyromonadaceae引起。同時(shí)我們?cè)诩?xì)

8、菌相對(duì)豐度的基礎(chǔ)上，在綱、目、科的水平上對(duì)樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)在科的水平上來(lái)自12-24小時(shí)、30-48小時(shí)和3-14天的糞便樣品可以被清楚地分為三個(gè)簇，與第一部分中肝臟再生三個(gè)生理階段的劃分相符。因此在下一步功能基因預(yù)測(cè)分析中，我們分別選用12小時(shí)、48小時(shí)和14天作為每一階段的標(biāo)志時(shí)間點(diǎn)。在術(shù)后12小時(shí)，腸道菌群功能基因在與代謝相關(guān)的途徑相對(duì)含量較高，如“l(fā)ipis metabolism”、“carbohydratemetabol

9、ism”，而48小時(shí)細(xì)菌的編碼基因更多的與基因生物合成加工有關(guān)，如“replication and repair”，同時(shí)在與腸道細(xì)菌代謝物質(zhì)相關(guān)的功能類(lèi)群的相對(duì)含量也較高。
　　結(jié)論：本研究描繪了肝臟再生過(guò)程中腸道微生物群落的整體結(jié)構(gòu)的變化，鑒定出與肝再生相關(guān)的關(guān)鍵功能菌，并初步解讀這些細(xì)菌的潛在功能，為理解腸道細(xì)菌和肝臟再生的重要關(guān)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　第三部分 肝臟再生過(guò)程中腸道菌群與代謝物質(zhì)共變化研究
　　目的

10、：肝臟部分切除所觸發(fā)的肝細(xì)胞增殖活動(dòng)使機(jī)體對(duì)能量的需求增加，正如本研究第二部分中觀察到的，腸道菌群作為功能性“代謝器官”，其功能基因組調(diào)節(jié)的代謝途徑在PH術(shù)后發(fā)生了改變，這些變化是否參與了肝臟再生宿主代謝過(guò)程仍是個(gè)謎題，也正是本研究第三部分的探討重點(diǎn)。
　　方法：通過(guò)超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC/MS)技術(shù)鑒定肝臟再生宿主代謝譜特征，篩選肝再生相關(guān)的生物標(biāo)志物，并結(jié)合代謝途徑分析法(MetPA)確定差異性代謝通路，最終建立肝臟再

11、生過(guò)程中腸道菌群與代謝途徑的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果：應(yīng)用主成分分析及正交偏最小二乘-判別分析法對(duì)UPLS/MS數(shù)據(jù)分析顯示，肝臟再生早期（12-24小時(shí)）、中期（30-36小時(shí)）及晚期（3-14天）血液樣品的代謝譜在空間上均能得到很好的區(qū)隔。根據(jù)VIP和非參數(shù)t-test結(jié)果，我們鑒定了在正常組與PH間有顯著差異的84個(gè)標(biāo)志物，主要包括七大類(lèi)物質(zhì):膽汁酸、膽素原、甘油磷脂、氨基酸、脂肪酸、?；舛緣A和維生素。在這84個(gè)代謝物中，我們發(fā)現(xiàn)

12、有15個(gè)物質(zhì)在肝臟再生的三個(gè)不同階段也存在表達(dá)差異，分別為腦磷脂(PE)(20∶4/14∶0)、卵磷脂(PC)(22∶5/15∶0)、PC(20∶3/15∶0)、溶血卵磷脂(Lysopc)(18∶4)、L-辛?；鈮A、膽紅素、L-尿膽原、泛素、D-白氨酸、D-葡萄糖胺、2，3-二氨基丙酸、1-甲基組胺、核糖醇、庚二酸、3-硫代脫氧膽酸鵝和亞牛磺酸。經(jīng)MetPA軟件分析，上述16種差異物質(zhì)積聚的代謝通路有花生四烯酸代謝、亞麻酸代謝、甘油磷

13、脂代謝、GPI錨蛋白生物合成、組氨酸代謝、?；撬峒皝喤；撬岽x、泛酸及輔酶A代謝、卟啉及葉綠素代謝。其中甘油磷脂和?；撬峒皝喤；撬岽x被鑒定為對(duì)代謝差異貢獻(xiàn)最大的兩條通路。最后結(jié)合spearman，rank correlation分析，將腸道菌群相對(duì)豐度數(shù)據(jù)與血液生物標(biāo)志物相對(duì)強(qiáng)度加以聯(lián)系，尋找腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)與宿主整體代謝的共變化特征，并且鑒定出8種與肝再生代謝密切的重要腸道細(xì)菌成員，分別是毛螺菌科、普雷沃氏菌科、瘤胃菌科、擬桿菌科、理研

14、菌科、紫單胞菌科、梭菌科和柔膜菌科。其中一些細(xì)菌與多種血液代謝濃度變化相關(guān)，如Butyricimonas、Erysipelotrichaceae incertae sedis和Paraprevotella，提示了這些細(xì)菌可能影響著肝再生過(guò)程中多個(gè)代謝通路。
　　結(jié)論：本研究中在描繪肝臟再生相關(guān)宿主代謝特征的同時(shí)，建立了腸道菌群與特征代謝物間的聯(lián)系，提示腸道菌群參與調(diào)節(jié)肝臟再生過(guò)程中的代謝平衡，為維持正常肝臟再生功能提供了新的研究視