大鼠肝臟缺血再灌注損傷與肝臟代謝產(chǎn)物的相關(guān)性研究.pdf

1、在肝臟手術(shù)中，為了減少出血，經(jīng)常需要進行肝血流的阻斷，而各種血流阻斷必然會造成肝臟的缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury，IRI)。缺血再灌注的損傷不但會造成大量的肝細胞直接損害，而且影響了肝細胞再生的能力，是影響肝臟手術(shù)成功率和患者術(shù)后生存率的重要因素之一。隨著手術(shù)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有大量的肝癌、肝纖維化、脂肪肝等肝病患者進行了復(fù)雜的、較大范圍的肝切除術(shù)甚至行肝移植術(shù)。盡管通過對肝臟解剖更進一

2、步的熟悉掌握，特別是肝內(nèi)膽道、血管解剖以及術(shù)中通過在麻醉過程中降低靜脈壓力，各種切、凝手術(shù)器械的發(fā)展使得非血流阻斷下手術(shù)切肝成為現(xiàn)實。目前通過阻斷血流減少術(shù)中出血，仍是肝臟手術(shù)的常用手段。較為常用的阻斷方法有第一肝門阻斷、全肝血流阻斷、選擇性入肝血流阻斷等等。無論哪一種血流阻斷的方式，都可以在一定程度上降低肝臟手術(shù)中出血的發(fā)生率。但缺血再灌注損傷仍然是必須面對且復(fù)雜的問題。除了肝臟血清酶學檢測、病理組織切片、CT等手段，能否找到一種新的

3、檢測手段，更全面判斷肝切除、肝移植術(shù)后患者的肝功能情況，甚至對其他相關(guān)器官的影響，從而為更好的、全面的進一步診斷及治療提供線索。
　　 用壓迫肝十二指腸韌帶控制肝臟出血的Pringle法，因其操作簡便、易行，且效果確切，是目前臨床運用最為廣泛的，用于控制切肝出血的措施，幾乎可用于所有肝臟手術(shù)中。本研究采用Pringle法構(gòu)建了肝臟缺血再灌注模型，對于缺血再灌注的研究，有較高的代表性。
　　 代謝組學發(fā)展于20世紀90年代

4、，通過體外因素，對生物體內(nèi)代謝物的變化進行定量分析，尋找代謝物類型和數(shù)量變化與生理及病理變化的相互關(guān)系和動態(tài)規(guī)律。代謝組學著重研究的是生物整體、器官或組織內(nèi)源性代謝物質(zhì)途徑及其所受內(nèi)在或外在因素的影響及隨時間變化的規(guī)律?？赏ㄟ^對代謝樣本的代謝產(chǎn)物分析，運用模式結(jié)合軟件，分析有差異的代謝物，找出潛在的標記物(biomarker)，為疾病的診斷提供依據(jù)。代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學后出現(xiàn)的一門新興學科，且可以作為一門新的臨床生

5、化技術(shù)用到某些疾病的檢測、診斷和治療。尿素酶預(yù)處理-氣相色譜-質(zhì)譜法(gaschromatography-mass spectrometry，GC/MS)是代謝組學研究中的重要方法，具有較高靈敏性，能夠分析高度復(fù)雜的生物體液。不僅能使樣品的分離、鑒定和定量一次性且迅速完成，還可以很大程度促進對批量物質(zhì)的整體和動態(tài)分析。GC/MS能夠一次性測定上百個分子量小于1000的分子，能夠瞬間勾勒出肝臟中合成和利用小分子代謝的情況。與目前常規(guī)運用于

6、臨床的血清酶學的肝功能檢測、病理、CT等手段相似，體現(xiàn)了某個階段肝功能的大致情況，同時還可以反映出其他器官如腎臟、心臟等器官的信息，甚至可以用于對比用藥前后藥物從機體代謝的情況。目前暫未有關(guān)于代謝組學運用于肝臟術(shù)后缺血再灌注損傷評估的報道。
　　 肝臟是人體最大的代謝器官，被譽為“物質(zhì)代謝中樞”，能夠代謝糖、蛋白、脂肪、維生素、激素等。對于維持機體內(nèi)環(huán)境平衡起到非常重要的作用。目前缺少一種方法，能夠在整體層面上反映機體代謝情況，

7、全面檢測肝臟各個時間段代謝產(chǎn)物的動態(tài)分布以評估疾病治療及預(yù)后。目前，利用代謝組學對于肝移植、肝硬化、乙型肝炎、脂肪肝等的研究已逐步展開。本實驗的研究目的在于利用代謝組學的方法對比肝臟缺血再灌注損傷前后代謝產(chǎn)物的變化，了解肝臟術(shù)后代謝的損傷、轉(zhuǎn)歸的變化趨勢，結(jié)合血清酶學、病理等常規(guī)方法，更完善地檢測肝臟術(shù)前、術(shù)后情況，全面的檢測肝臟的情況。
　　 代謝組學主要以尿液、血液、組織勻漿等為研究對象，標本較易獲得，監(jiān)測較為方便。目前代謝

8、組學主要有核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(mass spectrometry)兩種理論學說。研究較新的傾向于質(zhì)譜，GC/MS色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)比質(zhì)譜更加完善，是目前運用最為廣泛的分離分析技術(shù)且分析能力強，靈敏度較高。本研究采用代謝組學GC/MS的方法，對大鼠肝臟缺血再灌注損傷前后進行對比、分析，尋找早期檢測、診斷的重要標志物，對于臨床運用有一定的價值。
　　 材料和方法：
　　 1.大鼠缺血再灌注模型的建立
　　 取SP

9、F級純系SD(Spargue-Dawley)雄性大鼠，質(zhì)量均為220-250 g。
　　 1.1分組
　　 將大鼠隨機分成對照組(20)和實驗組(60)，實驗組按照設(shè)計時間點（術(shù)后1、3、5天）隨機分三組(n=20)。
　　 1.2模型制作
　　 1.2.1實驗組SD大鼠采用乙醚吸入麻醉后，取腹部正中切口進入腹腔。充分顯露第一肝門，予血管夾橫貫肝動脈、門靜脈、膽總管，夾閉30分鐘，后松開、關(guān)腹。術(shù)后，按照

10、實驗設(shè)計的時間點，分別于術(shù)后1、3、5天收集尿液標本，并在尿液標本收集完成后再次開腹獲取血液及肝臟標本。
　　 1.2.2對照組SD大鼠直接收集尿液標本，開腹獲取血液及肝臟標本。
　　 2.標本收集
　　 2.1尿液標本的收集
　　 2.1.1各組大鼠在開腹前12小時置入代謝籠中收集尿液，約每只4ml。
　　 2.1.2所取尿液標本存儲于-20℃冰箱，一周內(nèi)進行標準化處理后，進行代謝組學GC/MS

11、檢測。
　　 2.2血清酶學檢測
　　 2.2.1各組按規(guī)定的時間開腹，取門靜脈血，約3ml每只。
　　 2.2.2血液標本靜置10分鐘后，離心，取血清標本凍存于-70℃冰箱，一并送檢，測量血清AST、TBIL、ALP。
　　 2.3肝臟HE病理
　　 2.3.1完成靜脈血標本收集后，完整取出肝臟組織，快速切取肝中葉標本，置入10％中性甲醛溶液固定。統(tǒng)一進行脫水，石蠟包埋、切片，按標準操作行HE染

12、色，光鏡下觀察結(jié)果。
　　 3.統(tǒng)計學分析
　　 3.1血清酶學指標分析:應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義;由于數(shù)據(jù)多數(shù)不滿足正態(tài)，采用開平方根轉(zhuǎn)換使得數(shù)據(jù)基本達到正態(tài);計量資料以(x)±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法;丙酮酸和丙氨酸轉(zhuǎn)換后仍不滿足正態(tài)，多組比較采用非參秩和Kruskal-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney

13、 U檢驗。對P值進行Bonferroni校正。
　　 3.2代謝組學的主成分分析Principle component analysis(PCA):所有的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS統(tǒng)計軟件。檢驗水準α設(shè)為0.05，當需要進行多重比較時，校驗值設(shè)為0.01。
　　 結(jié)果：
　　 1.血清酶學指標:ALT、TBIL在術(shù)后1天組明顯升高，術(shù)后3天逐漸下降，至術(shù)后5天逐漸恢復(fù)至正常水平。
　　 2.病理HE結(jié)果:按S

14、uzuki評分標準，術(shù)后1天:肝細胞損傷較為嚴重，有較多的細胞出現(xiàn)壞死，有明顯的充血、淤血表現(xiàn)，可見少量空泡。術(shù)后3天:較術(shù)后1天有所好轉(zhuǎn)，可見肝細胞形態(tài)逐步在恢復(fù)，肝血竇代償性擴張，仍有極少量空泡;偶可見個別壞死細胞;有極少量充血表現(xiàn)。術(shù)后5天:未見有空泡形成;未見有壞死細胞;仍有極少的淤血、充血表現(xiàn)?；疽呀?jīng)恢復(fù)至正常水平。對照組（正常肝組織）:肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇呈條索狀，排列緊密，肝細胞形態(tài)正常，核深染，胞質(zhì)均勻。
　　

15、 3.代謝組學結(jié)果:術(shù)后1天，乳酸、甘油3磷酸較正常組明顯升高;術(shù)后3天至術(shù)后5天逐漸下降至正常水平。丙氨酸、絲氨酸在術(shù)后1天明顯降低;術(shù)后3天至5天逐步升高至接近正常水平。丙酮酸、蘇氨酸、油酸沒有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠肝門阻斷30分鐘后，肝臟的缺血再灌注損傷術(shù)后第一天最為嚴重，血清酶學指標達高峰、病理損傷最為嚴重;術(shù)后第3天開始好轉(zhuǎn)，至術(shù)后第5天已基本恢復(fù)至正常水平。血清酶學、肝臟的病理切片結(jié)果所反

16、應(yīng)的變化趨勢基本一致。
　　 2.尿素酶預(yù)處理-氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)的代謝組學方法觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷前后尿液中的代謝產(chǎn)物:糖代謝中的乳酸;蛋白質(zhì)代謝中丙氨酸、絲氨酸;脂質(zhì)代謝中的甘油3磷酸等指標的變化趨勢同血清酶學、肝臟病理切片結(jié)果符合。
　　 3.用GC/MS的代謝組學方法，通過尿液，可以真實地反映出大鼠肝臟缺血再灌注損傷及恢復(fù)