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文檔簡(jiǎn)介
1、在肝臟手術(shù)中,為了減少出血,經(jīng)常需要進(jìn)行肝血流的阻斷,而各種血流阻斷必然會(huì)造成肝臟的缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury,IRI)。缺血再灌注的損傷不但會(huì)造成大量的肝細(xì)胞直接損害,而且影響了肝細(xì)胞再生的能力,是影響肝臟手術(shù)成功率和患者術(shù)后生存率的重要因素之一。隨著手術(shù)技術(shù)的不斷發(fā)展,已有大量的肝癌、肝纖維化、脂肪肝等肝病患者進(jìn)行了復(fù)雜的、較大范圍的肝切除術(shù)甚至行肝移植術(shù)。盡管通過(guò)對(duì)肝臟解剖更進(jìn)一
2、步的熟悉掌握,特別是肝內(nèi)膽道、血管解剖以及術(shù)中通過(guò)在麻醉過(guò)程中降低靜脈壓力,各種切、凝手術(shù)器械的發(fā)展使得非血流阻斷下手術(shù)切肝成為現(xiàn)實(shí)。目前通過(guò)阻斷血流減少術(shù)中出血,仍是肝臟手術(shù)的常用手段。較為常用的阻斷方法有第一肝門(mén)阻斷、全肝血流阻斷、選擇性入肝血流阻斷等等。無(wú)論哪一種血流阻斷的方式,都可以在一定程度上降低肝臟手術(shù)中出血的發(fā)生率。但缺血再灌注損傷仍然是必須面對(duì)且復(fù)雜的問(wèn)題。除了肝臟血清酶學(xué)檢測(cè)、病理組織切片、CT等手段,能否找到一種新的
3、檢測(cè)手段,更全面判斷肝切除、肝移植術(shù)后患者的肝功能情況,甚至對(duì)其他相關(guān)器官的影響,從而為更好的、全面的進(jìn)一步診斷及治療提供線索。
用壓迫肝十二指腸韌帶控制肝臟出血的Pringle法,因其操作簡(jiǎn)便、易行,且效果確切,是目前臨床運(yùn)用最為廣泛的,用于控制切肝出血的措施,幾乎可用于所有肝臟手術(shù)中。本研究采用Pringle法構(gòu)建了肝臟缺血再灌注模型,對(duì)于缺血再灌注的研究,有較高的代表性。
代謝組學(xué)發(fā)展于20世紀(jì)90年代
4、,通過(guò)體外因素,對(duì)生物體內(nèi)代謝物的變化進(jìn)行定量分析,尋找代謝物類(lèi)型和數(shù)量變化與生理及病理變化的相互關(guān)系和動(dòng)態(tài)規(guī)律。代謝組學(xué)著重研究的是生物整體、器官或組織內(nèi)源性代謝物質(zhì)途徑及其所受內(nèi)在或外在因素的影響及隨時(shí)間變化的規(guī)律??赏ㄟ^(guò)對(duì)代謝樣本的代謝產(chǎn)物分析,運(yùn)用模式結(jié)合軟件,分析有差異的代謝物,找出潛在的標(biāo)記物(biomarker),為疾病的診斷提供依據(jù)。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后出現(xiàn)的一門(mén)新興學(xué)科,且可以作為一門(mén)新的臨床生
5、化技術(shù)用到某些疾病的檢測(cè)、診斷和治療。尿素酶預(yù)處理-氣相色譜-質(zhì)譜法(gaschromatography-mass spectrometry,GC/MS)是代謝組學(xué)研究中的重要方法,具有較高靈敏性,能夠分析高度復(fù)雜的生物體液。不僅能使樣品的分離、鑒定和定量一次性且迅速完成,還可以很大程度促進(jìn)對(duì)批量物質(zhì)的整體和動(dòng)態(tài)分析。GC/MS能夠一次性測(cè)定上百個(gè)分子量小于1000的分子,能夠瞬間勾勒出肝臟中合成和利用小分子代謝的情況。與目前常規(guī)運(yùn)用于
6、臨床的血清酶學(xué)的肝功能檢測(cè)、病理、CT等手段相似,體現(xiàn)了某個(gè)階段肝功能的大致情況,同時(shí)還可以反映出其他器官如腎臟、心臟等器官的信息,甚至可以用于對(duì)比用藥前后藥物從機(jī)體代謝的情況。目前暫未有關(guān)于代謝組學(xué)運(yùn)用于肝臟術(shù)后缺血再灌注損傷評(píng)估的報(bào)道。
肝臟是人體最大的代謝器官,被譽(yù)為“物質(zhì)代謝中樞”,能夠代謝糖、蛋白、脂肪、維生素、激素等。對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡起到非常重要的作用。目前缺少一種方法,能夠在整體層面上反映機(jī)體代謝情況,
7、全面檢測(cè)肝臟各個(gè)時(shí)間段代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)分布以評(píng)估疾病治療及預(yù)后。目前,利用代謝組學(xué)對(duì)于肝移植、肝硬化、乙型肝炎、脂肪肝等的研究已逐步展開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于利用代謝組學(xué)的方法對(duì)比肝臟缺血再灌注損傷前后代謝產(chǎn)物的變化,了解肝臟術(shù)后代謝的損傷、轉(zhuǎn)歸的變化趨勢(shì),結(jié)合血清酶學(xué)、病理等常規(guī)方法,更完善地檢測(cè)肝臟術(shù)前、術(shù)后情況,全面的檢測(cè)肝臟的情況。
代謝組學(xué)主要以尿液、血液、組織勻漿等為研究對(duì)象,標(biāo)本較易獲得,監(jiān)測(cè)較為方便。目前代謝
8、組學(xué)主要有核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(mass spectrometry)兩種理論學(xué)說(shuō)。研究較新的傾向于質(zhì)譜,GC/MS色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)比質(zhì)譜更加完善,是目前運(yùn)用最為廣泛的分離分析技術(shù)且分析能力強(qiáng),靈敏度較高。本研究采用代謝組學(xué)GC/MS的方法,對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷前后進(jìn)行對(duì)比、分析,尋找早期檢測(cè)、診斷的重要標(biāo)志物,對(duì)于臨床運(yùn)用有一定的價(jià)值。
材料和方法:
1.大鼠缺血再灌注模型的建立
取SP
9、F級(jí)純系SD(Spargue-Dawley)雄性大鼠,質(zhì)量均為220-250 g。
1.1分組
將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(20)和實(shí)驗(yàn)組(60),實(shí)驗(yàn)組按照設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后1、3、5天)隨機(jī)分三組(n=20)。
1.2模型制作
1.2.1實(shí)驗(yàn)組SD大鼠采用乙醚吸入麻醉后,取腹部正中切口進(jìn)入腹腔。充分顯露第一肝門(mén),予血管夾橫貫肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈、膽總管,夾閉30分鐘,后松開(kāi)、關(guān)腹。術(shù)后,按照
10、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn),分別于術(shù)后1、3、5天收集尿液標(biāo)本,并在尿液標(biāo)本收集完成后再次開(kāi)腹獲取血液及肝臟標(biāo)本。
1.2.2對(duì)照組SD大鼠直接收集尿液標(biāo)本,開(kāi)腹獲取血液及肝臟標(biāo)本。
2.標(biāo)本收集
2.1尿液標(biāo)本的收集
2.1.1各組大鼠在開(kāi)腹前12小時(shí)置入代謝籠中收集尿液,約每只4ml。
2.1.2所取尿液標(biāo)本存儲(chǔ)于-20℃冰箱,一周內(nèi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,進(jìn)行代謝組學(xué)GC/MS
11、檢測(cè)。
2.2血清酶學(xué)檢測(cè)
2.2.1各組按規(guī)定的時(shí)間開(kāi)腹,取門(mén)靜脈血,約3ml每只。
2.2.2血液標(biāo)本靜置10分鐘后,離心,取血清標(biāo)本凍存于-70℃冰箱,一并送檢,測(cè)量血清AST、TBIL、ALP。
2.3肝臟HE病理
2.3.1完成靜脈血標(biāo)本收集后,完整取出肝臟組織,快速切取肝中葉標(biāo)本,置入10%中性甲醛溶液固定。統(tǒng)一進(jìn)行脫水,石蠟包埋、切片,按標(biāo)準(zhǔn)操作行HE染
12、色,光鏡下觀察結(jié)果。
3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3.1血清酶學(xué)指標(biāo)分析:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;由于數(shù)據(jù)多數(shù)不滿足正態(tài),采用開(kāi)平方根轉(zhuǎn)換使得數(shù)據(jù)基本達(dá)到正態(tài);計(jì)量資料以(x)±s表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey法;丙酮酸和丙氨酸轉(zhuǎn)換后仍不滿足正態(tài),多組比較采用非參秩和Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Mann-Whitney
13、 U檢驗(yàn)。對(duì)P值進(jìn)行Bonferroni校正。
3.2代謝組學(xué)的主成分分析Principle component analysis(PCA):所有的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為0.05,當(dāng)需要進(jìn)行多重比較時(shí),校驗(yàn)值設(shè)為0.01。
結(jié)果:
1.血清酶學(xué)指標(biāo):ALT、TBIL在術(shù)后1天組明顯升高,術(shù)后3天逐漸下降,至術(shù)后5天逐漸恢復(fù)至正常水平。
2.病理HE結(jié)果:按S
14、uzuki評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后1天:肝細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重,有較多的細(xì)胞出現(xiàn)壞死,有明顯的充血、淤血表現(xiàn),可見(jiàn)少量空泡。術(shù)后3天:較術(shù)后1天有所好轉(zhuǎn),可見(jiàn)肝細(xì)胞形態(tài)逐步在恢復(fù),肝血竇代償性擴(kuò)張,仍有極少量空泡;偶可見(jiàn)個(gè)別壞死細(xì)胞;有極少量充血表現(xiàn)。術(shù)后5天:未見(jiàn)有空泡形成;未見(jiàn)有壞死細(xì)胞;仍有極少的淤血、充血表現(xiàn)?;疽呀?jīng)恢復(fù)至正常水平。對(duì)照組(正常肝組織):肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝竇呈條索狀,排列緊密,肝細(xì)胞形態(tài)正常,核深染,胞質(zhì)均勻。
15、 3.代謝組學(xué)結(jié)果:術(shù)后1天,乳酸、甘油3磷酸較正常組明顯升高;術(shù)后3天至術(shù)后5天逐漸下降至正常水平。丙氨酸、絲氨酸在術(shù)后1天明顯降低;術(shù)后3天至5天逐步升高至接近正常水平。丙酮酸、蘇氨酸、油酸沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)論:
1.大鼠肝門(mén)阻斷30分鐘后,肝臟的缺血再灌注損傷術(shù)后第一天最為嚴(yán)重,血清酶學(xué)指標(biāo)達(dá)高峰、病理?yè)p傷最為嚴(yán)重;術(shù)后第3天開(kāi)始好轉(zhuǎn),至術(shù)后第5天已基本恢復(fù)至正常水平。血清酶學(xué)、肝臟的病理切片結(jié)果所反
16、應(yīng)的變化趨勢(shì)基本一致。
2.尿素酶預(yù)處理-氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS)的代謝組學(xué)方法觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷前后尿液中的代謝產(chǎn)物:糖代謝中的乳酸;蛋白質(zhì)代謝中丙氨酸、絲氨酸;脂質(zhì)代謝中的甘油3磷酸等指標(biāo)的變化趨勢(shì)同血清酶學(xué)、肝臟病理切片結(jié)果符合。
3.用GC/MS的代謝組學(xué)方法,通過(guò)尿液,可以真實(shí)地反映出大鼠肝臟缺血再灌注損傷及恢復(fù)
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