大鼠肝臟部分切除術(shù)后肝臟再生及微小肝癌復(fù)發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究及其干預(yù)策略.pdf

1、背景和目的：肝細(xì)胞癌簡稱肝癌，居全世界癌癥發(fā)病率的第5位，死亡率居第3位，年死亡約600000例。手術(shù)切除包括肝臟部分切除術(shù)和肝移植術(shù)，是目前唯一有可能根治HCC的方法。然而，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)成為影響肝癌患者預(yù)后的主要因素之一，現(xiàn)多認(rèn)為其與術(shù)后殘余肝臟中的肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶的播散或原發(fā)潛伏癌灶的復(fù)燃有關(guān)。
　　 肝臟再生是肝臟部分切除和肝部分移植術(shù)后經(jīng)歷的自然過程，也是肝臟外科醫(yī)生術(shù)前必須考慮的因素，剩余健康肝臟的體積和再生能力制約著外

2、科手術(shù)切除范圍和患者的預(yù)后。肝臟外科的手術(shù)應(yīng)激和缺血損傷以及術(shù)后肝臟再生過程伴隨的細(xì)胞和分子生物學(xué)的改變，可能激活潛伏的微小癌灶、加速腫瘤的代謝和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。因此，權(quán)衡如何抑制腫瘤復(fù)燃、維持剩余肝臟功能并促進(jìn)外科術(shù)后肝臟再生就成為臨床肝臟外科的難點(diǎn)和重點(diǎn)。
　　 本研究首先假設(shè)肝臟部分切除術(shù)后肝內(nèi)肝癌微小轉(zhuǎn)移灶或原發(fā)潛伏癌灶的肝癌細(xì)胞增殖加速、侵襲性增強(qiáng)，并與切除體積相關(guān)。在建立大鼠肝臟部分切除術(shù)后肝內(nèi)微小肝癌復(fù)發(fā)模型的基礎(chǔ)上，

3、探尋肝臟部分切除術(shù)、肝臟再生和肝癌復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。
　　 然后，從肝癌活化、增殖與肝臟再生的分子機(jī)制的不同點(diǎn)入手，觀察Sorafenib對不同肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞以及大鼠微小肝癌復(fù)發(fā)的影響，尋找抑制腫瘤和維持肝臟基本功能、促進(jìn)肝臟再生的藥物干預(yù)方案。
　　 最后，從肝癌、肝臟再生與干細(xì)胞理論的聯(lián)系為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探究肝臟再生與微小肝癌復(fù)發(fā)的其演變及其機(jī)制，為抑制術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、促進(jìn)肝臟再生提供新的理論依據(jù)和治療途徑。
　

4、　 材料和方法：Buffalo大鼠實(shí)施0％-80％不同體積的肝臟部分切除術(shù)，同時(shí)在肝右下葉被膜下種植含McA-RH7777肝癌細(xì)胞懸液(1.0×106/0.2ml)來建立肝臟切除術(shù)后微小肝癌復(fù)發(fā)模型，70％肝臟部分切除的大鼠作為對照。記錄大鼠肝臟部分切除術(shù)后21天，大鼠的體重、腫瘤的體積和數(shù)量；術(shù)后第3、7和21天，血清肝臟功能指標(biāo)和免疫染色法檢測肝組織Cyclin D1和Ki-67來反映肝臟再生；術(shù)后21天，免疫染色法檢測腫瘤和肝組

5、織中甲胎球蛋白(α-fetoprotein，αFP)、Ki-67、Cyclin D1、Calpain-small subunit1(CAPNS1)、CD34和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，比較腫瘤增殖情況和侵襲性。術(shù)后3、7和21天肝臟再生組織，CK19和αFP免疫熒光雙重染色判定肝卵圓細(xì)胞活化狀態(tài)。
　　 Sorafenib溶解于DMSO，配置成含0.1-

6、10μM濃度梯度，DMSO按照0.1％(v/v)的濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液；通過3H-Thymidinine細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)比較Sorafenib對大鼠肝臟原代細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系的體外增殖和細(xì)胞活性作用的差異，免疫染色法檢測MAKT/AKT細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路活性的變化。大鼠活體實(shí)驗(yàn)中，Sorafenib溶解于混合的蓖麻油聚氧乙烯醚；70％肝臟部分切除術(shù)、在肝右下葉被膜下種植含McA-RH7777肝癌細(xì)胞的Buffalo大鼠，術(shù)后每

7、日按照2.5和10mg/kg管飼Sorafenib混合液；術(shù)后21天，記錄大鼠的體重、腫瘤的體積和數(shù)量，免疫染色法檢測腫瘤組織中腫瘤指標(biāo)(Cyclin D1、Ki-67、αFP、CD34和VEGF)的水平，血清肝臟功能指標(biāo)和免疫染色法檢測肝組織再生指標(biāo)(Cyclin D1和Ki-67)來反映肝臟再生。
　　 結(jié)果：
　　 1.實(shí)施肝臟部分切除術(shù)的大鼠，腫瘤體積顯著性增加(P<0.05)，與肝臟切除體積、肝臟再生程度正相關(guān)

8、；隨著切除體積的增加，腫瘤組織中Cyclin D1、αFP、Ki67、CAPNS1、CD34和VEGF等表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，肺浸潤、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05)。
　　 2.Sorafenib和EGF培養(yǎng)的肝臟原代細(xì)胞活性、增殖能力和MAKT/AKT信號通路激酶活性均顯著高于肝癌細(xì)胞McA-RH7777、Bel7402和HepG2細(xì)胞(P<0.05)；實(shí)施70％肝臟部分切除術(shù)和肝癌細(xì)胞種植的大鼠管飼Sorafen

9、ib后，在術(shù)后21天腫瘤體積、數(shù)量以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著性減少(P<0.05)，肝臟再生水平無變化(P>0.05)。
　　 3.動(dòng)態(tài)觀察肝臟部分切除術(shù)后肝臟再生與微小肝癌復(fù)發(fā)的變化：在術(shù)后3-7天，出現(xiàn)肝臟再生峰值；術(shù)后7-21天，70％和80％肝臟切除組的肝臟卵圓細(xì)胞活化；術(shù)后7-21天，隨著切除體積的增加，大鼠體重下降、肝臟功能惡化(P<0.05)，腫瘤體積增加。
　　 結(jié)論：本研究使用0％-80％不同切除體積的大鼠肝臟部

10、分切除術(shù)、在保留的肝右下葉種植肝癌細(xì)胞來建立大鼠肝臟部分切除術(shù)后微小肝癌復(fù)發(fā)模型，術(shù)后觀察21天來模擬臨床上肝臟切除術(shù)后潛伏的肝癌轉(zhuǎn)移灶或原發(fā)性微小肝癌早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。結(jié)果證實(shí)，微小肝癌增長和轉(zhuǎn)移的程度與肝臟部分切除術(shù)的體積以及肝臟再生的程度有關(guān)。
　　 在肝臟再生促進(jìn)肝癌術(shù)后微小肝癌增殖、轉(zhuǎn)移的研究基礎(chǔ)上，利用肝腫瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞MAPK/AKT細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)差異，使用RAF靶向抑制劑Sorafenib抑制腫瘤的增殖和遠(yuǎn)