水稻條紋病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆與抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻的培育.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、水稻條紋葉枯?。≧ice stripe disease)是水稻上普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的一種病毒病,其病原為水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)。近年來,隨著種植方式的改變,耕作栽培技術(shù)的變化,導(dǎo)致水稻條紋葉枯病在黃淮稻區(qū)迅速回升,1999年后暴發(fā)成災(zāi),目前已成為該稻區(qū)水稻生產(chǎn)上最主要的病害。水稻感染RSV后,造成水稻心葉褪綠,捻轉(zhuǎn),并弧圈裝下垂,嚴(yán)重的心葉枯死,導(dǎo)致水稻產(chǎn)量大幅降低,甚至絕產(chǎn)。RSV 主要由介體灰飛虱

2、持久性經(jīng)卵傳播,電鏡下觀察病毒粒子呈絲狀粒體,以折疊、分枝和超螺旋等形式存在。RNA 介導(dǎo)的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance,RMVR)是近年來發(fā)展起來的一種新的抗病毒基因工程策略,其通過對入侵的病毒RNA 進(jìn)行降解,使入侵的病毒不能在植物中積累,從而賦予轉(zhuǎn)基因植物病毒抗性。本研究探求了RSV 致病性增強(qiáng)的分子機(jī)理,并培育了高抗且穩(wěn)定遺傳到T2 代的抗水稻條紋病毒的轉(zhuǎn)基因水稻,對于提高水稻的產(chǎn)量,保護(hù)

3、水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展,具有重大意義。研究結(jié)果和主要結(jié)論如下:
   (1)水稻條紋病毒山東濟(jì)寧分離物的分子變異分析傳統(tǒng)的生物學(xué)測定發(fā)現(xiàn)RSV 不同分離物之間存在著化學(xué)組成和致病性上的差異。
   近些年的研究表明,這種差異同樣表現(xiàn)在核苷酸的水平。通過對部分分離物的RNA3、RNA4 或部分編碼基因的序列分析發(fā)現(xiàn),RSV的基因序列和5′端及3′端非編碼區(qū)序列相當(dāng)保守,變異主要發(fā)生在基因間隔區(qū)(IR),但目前尚缺乏對不同類型

4、病毒種群的遺傳變異的系統(tǒng)分析。
   從山東濟(jì)寧感病的水稻上,分離到強(qiáng)致病性水稻條紋病毒,命名為RSV-SD-JN2。
   為了從分子水平探討RSV-SD-JN2 變異及其致病性增強(qiáng)的原因,采用RT-PCR 技術(shù),克隆RSV-SD-JN2的RNA3、RNA4 區(qū)段cDNA。序列測定結(jié)果顯示,RSV-SD-JN2的RNA3和RNA4 核苷酸序列長度分別為2487bp、2157bp;RNA3中,NS3基因長為636bp,I

5、R為725bp,CP基因?yàn)?69bp;RNA4中,SP基因長為537bp,IR 為654bp,NSvc4基因?yàn)?61bp。
   將RSV-SD-JN2 與不同時(shí)期、不同區(qū)域和不同致病性的遼寧盤錦PJ、北京雙橋SQ、江蘇洪澤HZ、云南昆明KM、山東濟(jì)寧SD-JN1,江蘇江陰JY、浙江ZHEJIANG分離物的RNA3、RNA4 全序列或部分序列進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)RNA3、RNA4序列5′和3′末端非編碼區(qū)具有高度保守,僅存在個(gè)別堿

6、基的差異;基因編碼區(qū)保守性較高,核苷酸序列同源性均在93%以上,氨基酸序列同源性高達(dá)97%以上,且大部分堿基變異為無意義變異;IR 易于變異,IR4的核苷酸序列同源性僅在91.6%-94.3%之間,而IR3的同源性為85.8%-96.7%。IR的變異導(dǎo)致RNA 二級結(jié)構(gòu)-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性提高是病毒致病性增強(qiáng)的重要原因。同時(shí)發(fā)現(xiàn),SD-JN2分離物的RNA3 內(nèi)部各個(gè)序列可能存在不同的親緣關(guān)系;NS3基因和CP基因與HZ分離物有很高的同源

7、性,分別為98.9%和99.1%;而IR僅為86.3%,推測是由不同亞群的分離物的基因組相應(yīng)片段經(jīng)過交換重配引起的。
   (2)抗RSV兩種分離物轉(zhuǎn)基因水稻新種質(zhì)的培育目前,種植抗條紋葉枯病品種是防治RSV 最根本、有效的方法。而粳稻是黃淮稻區(qū)主要的種植品種,由于粳稻中缺少抗條紋葉枯病基因,病害的流行和發(fā)生已經(jīng)給水稻生產(chǎn)造成重大損失。常規(guī)的培育水稻抗病品種的方法周期長、效率低。RNA 介導(dǎo)病毒抗性是目前培育抗病毒作物最為有效而

8、且快捷的方式,其具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特點(diǎn),是一種具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的植物抗病毒基因工程策略。但是RNA 介導(dǎo)的病毒抗性還具有抗病性譜窄的缺點(diǎn)。為了克服這種缺點(diǎn),可以通過構(gòu)建包含同一病毒不同基因的嵌合基因片段的表達(dá)載體,導(dǎo)入植物,既可以提高抗性水平,又能增強(qiáng)對同一病毒不同分離物抗性范圍及抗性遺傳的穩(wěn)定性。本研究基于RNAi的原理,同時(shí)為了克服因病毒突變造成的抗性逃逸,培育了高抗、廣譜并且穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因水稻。

9、>   首先改造了pCAMBIA1300表達(dá)載體,加入了玉米泛素蛋白基因Ubi 啟動子,胭脂堿合成酶基因3′端Nos 終止子,將選擇標(biāo)記基因Hygromycin B 替換為生物安全性更高的Bar基因,構(gòu)建了新的表達(dá)載體pUNB。利用RSV-SD-JN2的CP、SP基因部分片度構(gòu)建了包含CP/SP 嵌合基因及單CP、單SP基因的RNAi 載體p1300CP/SP p1300CP、p1300SP;凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,利用農(nóng)桿菌介

10、導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,轉(zhuǎn)化水稻豫粳6號愈傷組織,分別獲得了T0 代轉(zhuǎn)基因植株23、24和17 棵。
   自交結(jié)實(shí)獲得T1 代株系,每個(gè)載體的T1 代轉(zhuǎn)基因株系各選取100 棵,用來自山東濟(jì)寧和江蘇淮安RSV分離物接種,病毒抗性的檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)化p1300CP/SP的轉(zhuǎn)基因株系中有CS1、CS3、CS6、CS7、CS10、CS13、CS15、CS16、CS19 株系,轉(zhuǎn)化p1300CP的轉(zhuǎn)基因株系中有CP1、CP3、CP4、CP7、C

11、P9、CP12 株系轉(zhuǎn)化,p1300SP的轉(zhuǎn)基因株系中中有SP2、SP5、SP6、SP7、SP13 株系對兩種病毒分離物的感病率都在6%以下,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)化空載體轉(zhuǎn)基因株系野生型株系的感病率,表現(xiàn)為抗性株系。三個(gè)載體其余株系的感病率都在12%以上,表現(xiàn)為中抗和感病株系。表明p1300CP/SP、p1300CP、p1300SP的T1 代轉(zhuǎn)基因株系中抗病株系的比率分別為39.13%、25.00%、29.41%。含CP/SP 嵌合基因的轉(zhuǎn)基因株

12、系的抗病性和廣譜性要好于轉(zhuǎn)化單CP基因和單SP基因的轉(zhuǎn)基因株系,說明同時(shí)干擾RSV多個(gè)基因的表達(dá),可以更加有效的抵御RSV 病毒的入侵,并且對不同地區(qū)分離物具有廣譜抗性。
   T1 代抗性株系的Southern 雜交顯示,外源基因以不同拷貝整合于水稻的基因組中,并進(jìn)行了有效表達(dá),且轉(zhuǎn)基因植株的抗病性與轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)之間無明顯的相關(guān)性;T1代抗性株系的總RNA和siRNA的Northern 雜交顯示,抗病植株中RNA的積累量明顯

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