水稻條紋病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆與抗RSV轉基因水稻的培育.pdf

1、水稻條紋葉枯?。≧ice stripe disease）是水稻上普遍發(fā)生、危害嚴重的一種病毒病，其病原為水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）。近年來，隨著種植方式的改變，耕作栽培技術的變化，導致水稻條紋葉枯病在黃淮稻區(qū)迅速回升，1999年后暴發(fā)成災，目前已成為該稻區(qū)水稻生產(chǎn)上最主要的病害。水稻感染RSV后，造成水稻心葉褪綠，捻轉，并弧圈裝下垂，嚴重的心葉枯死，導致水稻產(chǎn)量大幅降低，甚至絕產(chǎn)。RSV 主要由介體灰飛虱

2、持久性經(jīng)卵傳播，電鏡下觀察病毒粒子呈絲狀粒體，以折疊、分枝和超螺旋等形式存在。RNA 介導的病毒抗性（RNA-Mediated Virus Resistance，RMVR）是近年來發(fā)展起來的一種新的抗病毒基因工程策略，其通過對入侵的病毒RNA 進行降解，使入侵的病毒不能在植物中積累，從而賦予轉基因植物病毒抗性。本研究探求了RSV 致病性增強的分子機理，并培育了高抗且穩(wěn)定遺傳到T2 代的抗水稻條紋病毒的轉基因水稻，對于提高水稻的產(chǎn)量，保護

3、水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，具有重大意義。研究結果和主要結論如下：
　　 （1）水稻條紋病毒山東濟寧分離物的分子變異分析傳統(tǒng)的生物學測定發(fā)現(xiàn)RSV 不同分離物之間存在著化學組成和致病性上的差異。
　　 近些年的研究表明，這種差異同樣表現(xiàn)在核苷酸的水平。通過對部分分離物的RNA3、RNA4 或部分編碼基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，RSV的基因序列和5′端及3′端非編碼區(qū)序列相當保守，變異主要發(fā)生在基因間隔區(qū)(IR)，但目前尚缺乏對不同類型

4、病毒種群的遺傳變異的系統(tǒng)分析。
　　 從山東濟寧感病的水稻上，分離到強致病性水稻條紋病毒，命名為RSV-SD-JN2。
　　 為了從分子水平探討RSV-SD-JN2 變異及其致病性增強的原因，采用RT-PCR 技術，克隆RSV-SD-JN2的RNA3、RNA4 區(qū)段cDNA。序列測定結果顯示，RSV-SD-JN2的RNA3和RNA4 核苷酸序列長度分別為2487bp、2157bp；RNA3中，NS3基因長為636bp，I

5、R為725bp，CP基因為969bp；RNA4中，SP基因長為537bp，IR 為654bp，NSvc4基因為861bp。
　　 將RSV-SD-JN2 與不同時期、不同區(qū)域和不同致病性的遼寧盤錦PJ、北京雙橋SQ、江蘇洪澤HZ、云南昆明KM、山東濟寧SD-JN1，江蘇江陰JY、浙江ZHEJIANG分離物的RNA3、RNA4 全序列或部分序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)RNA3、RNA4序列5′和3′末端非編碼區(qū)具有高度保守，僅存在個別堿

6、基的差異；基因編碼區(qū)保守性較高，核苷酸序列同源性均在93％以上，氨基酸序列同源性高達97％以上，且大部分堿基變異為無意義變異；IR 易于變異，IR4的核苷酸序列同源性僅在91.6％-94.3％之間，而IR3的同源性為85.8％-96.7％。IR的變異導致RNA 二級結構－發(fā)夾結構的穩(wěn)定性提高是病毒致病性增強的重要原因。同時發(fā)現(xiàn)，SD-JN2分離物的RNA3 內(nèi)部各個序列可能存在不同的親緣關系；NS3基因和CP基因與HZ分離物有很高的同源

7、性，分別為98.9％和99.1％；而IR僅為86.3％，推測是由不同亞群的分離物的基因組相應片段經(jīng)過交換重配引起的。
　　 （2）抗RSV兩種分離物轉基因水稻新種質(zhì)的培育目前，種植抗條紋葉枯病品種是防治RSV 最根本、有效的方法。而粳稻是黃淮稻區(qū)主要的種植品種，由于粳稻中缺少抗條紋葉枯病基因，病害的流行和發(fā)生已經(jīng)給水稻生產(chǎn)造成重大損失。常規(guī)的培育水稻抗病品種的方法周期長、效率低。RNA 介導病毒抗性是目前培育抗病毒作物最為有效而

8、且快捷的方式，其具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特點，是一種具有實際應用價值的植物抗病毒基因工程策略。但是RNA 介導的病毒抗性還具有抗病性譜窄的缺點。為了克服這種缺點，可以通過構建包含同一病毒不同基因的嵌合基因片段的表達載體，導入植物，既可以提高抗性水平，又能增強對同一病毒不同分離物抗性范圍及抗性遺傳的穩(wěn)定性。本研究基于RNAi的原理，同時為了克服因病毒突變造成的抗性逃逸，培育了高抗、廣譜并且穩(wěn)定遺傳的轉基因水稻。

9、>　　 首先改造了pCAMBIA1300表達載體，加入了玉米泛素蛋白基因Ubi 啟動子，胭脂堿合成酶基因3′端Nos 終止子，將選擇標記基因Hygromycin B 替換為生物安全性更高的Bar基因，構建了新的表達載體pUNB。利用RSV-SD-JN2的CP、SP基因部分片度構建了包含CP/SP 嵌合基因及單CP、單SP基因的RNAi 載體p1300CP/SP p1300CP、p1300SP；凍融法導入農(nóng)桿菌EHA105，利用農(nóng)桿菌介

10、導的轉化方法，轉化水稻豫粳6號愈傷組織，分別獲得了T0 代轉基因植株23、24和17 棵。
　　 自交結實獲得T1 代株系，每個載體的T1 代轉基因株系各選取100 棵，用來自山東濟寧和江蘇淮安RSV分離物接種，病毒抗性的檢測結果顯示：轉化p1300CP/SP的轉基因株系中有CS1、CS3、CS6、CS7、CS10、CS13、CS15、CS16、CS19 株系，轉化p1300CP的轉基因株系中有CP1、CP3、CP4、CP7、C

11、P9、CP12 株系轉化，p1300SP的轉基因株系中中有SP2、SP5、SP6、SP7、SP13 株系對兩種病毒分離物的感病率都在6％以下，遠遠低于轉化空載體轉基因株系野生型株系的感病率，表現(xiàn)為抗性株系。三個載體其余株系的感病率都在12％以上，表現(xiàn)為中抗和感病株系。表明p1300CP/SP、p1300CP、p1300SP的T1 代轉基因株系中抗病株系的比率分別為39.13％、25.00％、29.41％。含CP/SP 嵌合基因的轉基因株

12、系的抗病性和廣譜性要好于轉化單CP基因和單SP基因的轉基因株系，說明同時干擾RSV多個基因的表達，可以更加有效的抵御RSV 病毒的入侵，并且對不同地區(qū)分離物具有廣譜抗性。
　　 T1 代抗性株系的Southern 雜交顯示，外源基因以不同拷貝整合于水稻的基因組中，并進行了有效表達，且轉基因植株的抗病性與轉基因的拷貝數(shù)之間無明顯的相關性；T1代抗性株系的總RNA和siRNA的Northern 雜交顯示，抗病植株中RNA的積累量明顯