Pleiotrophin對(duì)大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)及肝組織再生影響的研究.pdf

1、肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，擔(dān)負(fù)消化、解毒、分泌和生物合成功能，其功能障礙直接影響人體健康，甚至危及生命。在我國(guó)，最常見(jiàn)的肝臟疾病是病毒性肝炎，其中乙型病毒性肝炎以高感染率成為我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前對(duì)于肝臟疾病(包括病毒性肝炎)的治療主要包括內(nèi)科綜合治療、人工肝支持治療、肝移植手術(shù)、干細(xì)胞移植治療等。各種治療方式均存在缺陷和不足，難以達(dá)到完全恢復(fù)肝臟功能的目的，其主要原因是由于人們對(duì)于肝臟的生理機(jī)制了解局限，包括肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，肝臟

2、再生等過(guò)程的具體機(jī)制均不能完全了解，不能有效促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)及肝臟再生。 Pleiotrophin(PTN)，意為多效因子，是一種分泌性生長(zhǎng)因子，可分泌到細(xì)胞外，同肝素有高親和性，與中期因子(Midkine，MK)共同組成PTN/MK肝素結(jié)合蛋白超家族，是一類(lèi)新的肝素結(jié)合生長(zhǎng)/分化因子。PTN正常表達(dá)于胚胎期，在成年的健康組織中很少表達(dá)，主要來(lái)源于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞、神經(jīng)元、垂體

3、后葉細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)層角化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。亦有研究報(bào)道PTN可來(lái)源于肝星狀細(xì)胞。 PTN的功能主要有刺激細(xì)胞增殖與遷移、促血管生成、促神經(jīng)生長(zhǎng)、促骨發(fā)育及組織損傷后修復(fù)等。PTN對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞有一定的促有絲分裂作用，能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，因此認(rèn)為PTN是一種生長(zhǎng)因子。最近有研究表明：PTN是肝細(xì)胞的強(qiáng)分裂素，它與肝細(xì)胞的再生有關(guān)。 因此，本課題以探索肝細(xì)胞生長(zhǎng)及肝臟再生機(jī)制，了解PTN在肝細(xì)胞生長(zhǎng)及肝臟的

4、再生中的作用為目的，采用了細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化、原位雜交、分子生物學(xué)等技術(shù)，觀(guān)察了加入HLlman recombinant PTN (hrPTN)的肝細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)大鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響，包括生長(zhǎng)速度及ALB分泌功能；同時(shí)檢測(cè)了PTN mRNA在正常大鼠肝臟和大鼠肝損傷后再生模型中的表達(dá)差異。初步證實(shí)了其在肝細(xì)胞體外生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中及其在肝臟修復(fù)過(guò)程中的作用，為獲得增殖旺盛、生理功能良好的成熟肝細(xì)胞，以及挽救肝臟壞死、功能衰竭綜合防治研究

5、提供了理論基礎(chǔ)。全文分為2大部分： 第1章：Pleiotrophin對(duì)大鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)影響的研究。 第2章：Pleiotrophin在大鼠肝組織損傷后再生模型中的表達(dá)。 第1章：Pleiotriophin對(duì)大鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)影響的研究 1．目的：了解PTN在肝細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。 2．方法： 2.1．采用兩步膠原酶原位灌流法分離大鼠肝細(xì)胞，用PeFCOll分離液純化出肝細(xì)胞，純化后

6、細(xì)胞活力和純度均在90﹪以上。以1×10<'4>的密度進(jìn)行接種培養(yǎng)。 2.2．根據(jù)培養(yǎng)液不同分3組，A組培養(yǎng)液為HepatoZYME-SFM培養(yǎng)基，并添加胰島素、地塞米松、谷氨酰胺、HGF、EGF、NGF、氫化考的松，為空白對(duì)照組；B組加入1/3的條件培養(yǎng)液(正常Swiss-3T3細(xì)胞培養(yǎng)第3天的培養(yǎng)上清液)，為陽(yáng)性對(duì)照組；C組則添加hrPTN(100ng/ml)，為實(shí)驗(yàn)組。 2.3．倒置顯微鏡下觀(guān)察3組肝細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

7、，并爬片、HE染色，選取10個(gè)任意相同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以第1天和第7天細(xì)胞數(shù)的比值觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)率；使用自動(dòng)生化儀對(duì)3組大鼠肝細(xì)胞合成的ALB進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較細(xì)胞牛長(zhǎng)率和合成的ALB水平對(duì)3組肝細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。 3．結(jié)果： 3.1．3組肝細(xì)胞生長(zhǎng)率：加入3T3培養(yǎng)上清液的B組肝細(xì)胞生長(zhǎng)率最高，加入hrPTN的C組次之，空白A組最低； 3.2．比較3組肝細(xì)胞ALB分泌情況：加入3T3細(xì)胞培養(yǎng)液上清(B組)及

8、加入hrPTN(C組)后的兩組肝細(xì)胞合成ALB能維持較長(zhǎng)時(shí)間，在第8天后才出現(xiàn)明顯下降，而未加入組合成ALB功能在第6天即明顯下降；B、C兩組肝細(xì)胞合成ALB水平峰值比A組明顯增高，且這兩組ALB高值維持的時(shí)間亦比A組長(zhǎng)，大約5至6天，而A組只維持了2至3天。 4．結(jié)論：Pleiotrophin對(duì)大鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。 第2章：P1eiotrophin在大鼠肝組織損傷后再生模型中的表達(dá) 1．目的：研

9、究Pleiotroptlin在大鼠肝組織損傷后再生模型中的表達(dá)。 2．方法： 2.1．建立D-GalN及CCl<,4>所致的大鼠肝損傷后再生模型，眼球采血測(cè)其生化值(AST、ALT、ALB)，并進(jìn)行HE染色觀(guān)察其病理改變； 2.2．取再生模型第48小時(shí)、第120小時(shí)的大鼠肝組織及正常對(duì)照大鼠肝組織制石蠟切片，以地高辛標(biāo)記的PTN探針標(biāo)記，進(jìn)行PTN mRNA原位雜交，雜交后進(jìn)行DAB顯色，觀(guān)察其表達(dá)情況；

10、 2.3．同樣取再生模型第48小時(shí)、第120小時(shí)大鼠的肝組織及正常對(duì)照大鼠肝組織通過(guò)RT-PCR半定量方法進(jìn)行PTN mRNA分析。 3．結(jié)果： 3.1．建立CCl<,4>、D-GalN大鼠肝損傷后再生模型； 3.2．PTN mRNA原位雜交顯示D-GalN、CCl<,4>所致的大鼠肝損傷后再生模型均表達(dá)PTN mRNA，而正常大鼠肝組織中沒(méi)有PTN mRNA的表達(dá)； 3.3．半定量RT-PCR分析亦顯示