Tmub1對大鼠肝再生過程中肝細胞增殖及securin泛素化的影響.pdf

1、肝功能衰竭是各種肝臟疾病的終末期狀態(tài)，死亡率極高，是目前肝臟疾病治療的難點。近年來人工肝、組織工程等技術有了較大的突破，但這些技術仍有較大的局限性，生物人工肝的臨床療效有限，而組織工程技術又短時難以應用于臨床。目前肝臟移植是治療肝衰竭的唯一有效手段，但由于存在供體短缺、價格昂貴、免疫排斥等不足，難以廣泛開展。由于肝臟具有極強再生能力，在受到各種理化損傷后能通過自身的再生修復受損的肝臟組織和細胞，因此有效刺激肝臟自身的合理再生被認為是治療

2、肝臟功能衰竭的理想手段。對于肝臟外科而言，肝切除術(partial hepatectomy，PH)被廣泛應用于各種肝臟外科良惡性疾病的治療，而過多地切除肝臟組織也易導致術后肝功能衰竭。在肝切除術后，成熟肝細胞可以在一系列精密調控的情況下，通過增生和增殖進行肝再生。如果能夠增強肝臟本身的再生能力，并給予適當的約束和調控，將對肝功能衰竭的防治提供巨大的幫助，為肝臟外科醫(yī)生開展更大范圍的肝切除提供有力的支持。因此，研究肝切除術后的肝臟再生調控

3、網絡對于理解肝再生過程、防治肝衰竭具有非常重要的意義。
　　Tmub1（transmembrane and ubiquitin like domain containing1）是一個包含泛素樣結構域和跨膜結構域的核質穿梭蛋白。研究發(fā)現，在肝再生過程中，Tmub1迅速出核并高表達，發(fā)揮負向調控肝細胞增殖的作用，但目前對于Tmub1負向調控肝再生的機制仍缺乏了解。課題組通過前期研究發(fā)現，securin可能是Tmub1的下游靶蛋白之一。

4、Securin即分離酶抑制蛋白，在細胞周期調節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。在有絲分裂結束之前securin必須經過泛素化-蛋白酶體途徑降解，才能使細胞順利完成姐妹染色單體的分離。有研究表明，在內質網相關的蛋白降解通路(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)中，Tmub1可以與gp78和SPFH2形成復合體，介導HMG-CoA還原酶的泛素化，因此，Tmub1有可能通過參與securin

5、的泛素化降解過程來影響肝細胞的增殖。但是，Tmub1參與泛素化的現象和機制仍報道極少，而且目前人們對泛素樣蛋白的功能還沒有統(tǒng)一的認識，該類蛋白也可能通過非泛素化途徑發(fā)揮作用。因此，具體的作用機制需深入研究，Tmub1的泛素樣結構域(UBL)是否能直接或間接地參與泛素化調控也需要進一步明確。
　　目的：
　　1.利用大鼠70％肝切除模型，明確Tmub1和securin的mRNA和蛋白水平在肝再生全程中的表達規(guī)律及相關性。

6、>　　2.進一步明確Tmub1對大鼠正常肝細胞增殖能力、細胞周期和有絲分裂的影響。
　　3.明確Tmub1對securin泛素化調控過程的影響，并初步探索Tmub1的泛素樣結構域(UBL)在securin泛素化過程中的作用。
　　材料和方法：
　　1.通過構建大鼠70％肝切除再生模型，采用RT-qPCR和Western Blotting技術檢測Tmub1和securin在肝再生過程中的表達規(guī)律。
　　2.分別構建

7、Tmub1過表達和shRNA干擾的慢病毒載體，分別感染大鼠正常肝細胞系BRL-3A并建立穩(wěn)定感染細胞株，通過CCK-8、EdU、流式細胞術等方法檢測Tmub1表達對BRL-3A細胞增殖能力及細胞周期的影響。
　　3.采用細胞周期同步化和免疫熒光技術，觀察Tmub1過表達對BRL-3A細胞有絲分裂過程的影響，并使用Western Blotting檢測有絲分裂進程中cyclins（細胞周期素蛋白）的表達量。
　　4.使用免疫沉淀

8、、Western Blotting、RT-qPCR檢測Tmub1表達對securin的表達及其泛素化水平的影響。
　　5.構建Tmub1的UBL結構域突變體和截斷體質粒載體，檢測UBL結構域突變或缺失后的Tmub1對securin泛素化水平的影響。
　　6.實驗數據均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，使用GraphPad Prism6.0軟件繪制統(tǒng)計圖;計量資料結果以均數±標準差表示，采用t檢驗進行兩組間均數比較，單因素

9、方差分析與LSD法進行多組間均數比較。P＜0.05作為顯著統(tǒng)計學差異的標準。
　　結果：
　　1.Tmub1的mRNA和蛋白水平在大鼠70％肝切除術后均先升高，在術后24～48h達到高峰后降低;securin的mRNA和蛋白表達趨勢不一致，其mRNA水平在手術12h后逐漸增加，在術后48h達到高峰后逐漸降低，而其蛋白水平在術后逐漸降低，術后48h最低，至術后7d恢復較高水平;Tmub1表達水平和securin mRNA水平在

10、時間上呈正向相關，和securin蛋白水平在時間上呈負向相關。
　　2.增強Tmub1表達可使BRL-3A細胞增殖能力降低，而抑制Tmub1表達則導致BRL-3A細胞增殖能力增強。Tmub1過表達可顯著增加G1期的細胞比例，降低S及G2/M期的細胞比例，而抑制Tmub1表達則可顯著增加S期細胞比例，降低G1期細胞比例。
　　3.Tmub1過表達可影響B(tài)RL-3A細胞有絲分裂期進程，并影響cyclins在M期的表達水平。其中，

11、在陰性對照組BRL-3A細胞中，cyclinA和cyclin B1的表達量在有絲分裂第0.5h時即明顯降低，而在Tmub1過表達組中，cyclinA和cyclin B1的表達在1.5h時都仍維持較高水平。
　　4.過表達或干擾Tmub1對securin基因轉錄水平無明顯影響，但可影響其蛋白表達水平:過表達Tmub1可明顯增加securin蛋白表達，干擾Tmub1可明顯降低securin蛋白表達。
　　5.Tmub1過表達可下

12、調securin的泛素化水平，抑制Tmub1表達可增加securin的泛素化水平。
　　6.Tmub1的UBL結構域突變體和截斷體均不能引起securin泛素化水平的改變。BRL-3A細胞轉染UBL結構域突變體質粒后，securin泛素化水平與陰性對照組無明顯差異;轉染UBL結構域截斷體質粒后，securin泛素化水平與陰性對照組也無明顯差異。
　　結論：
　　Tmub1在肝再生過程中的表達具有明顯的規(guī)律性，可抑制肝細