肝再生過程中的LncRNAs調(diào)控肝細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、肝臟是人體各種物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換的樞紐器官，是機(jī)體內(nèi)多種重要信息調(diào)控分子的“集散地”。肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，創(chuàng)傷和各種肝臟病后，殘存的肝組織很快會進(jìn)入復(fù)雜的肝再生過程。肝再生過程基本可分為三個階段:早期階段（啟動期），中期階段（增殖期）和晚期階段（終止期）。肝再生一直是肝臟研究中的一個重要焦點，原發(fā)性肝癌、肝內(nèi)膽結(jié)石等肝臟病進(jìn)行肝部分切除術(shù)后常因肝功能儲備不足，術(shù)后并發(fā)肝功能衰竭而死亡率較高。因此研究肝再生分子機(jī)理對于解釋肝臟病人肝葉

2、切除術(shù)后殘余肝臟的再生機(jī)制，實施有效的促肝細(xì)胞再生，減輕肝葉切除術(shù)后的肝損害及評估預(yù)后具有重要的臨床意義。
　　 因為肝細(xì)胞再生的機(jī)制非常復(fù)雜影響因素很多，對肝臟再生的啟動和增殖信號（包括激素、生長因子和細(xì)胞因子等）的分子機(jī)制認(rèn)識有了初步了解。主要研究發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞因子(IL-6、TNF-a)和轉(zhuǎn)錄因子(c-jun、STAT3)等組成啟動肝再生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而提高促有絲分裂因子對肝細(xì)胞的增殖能力的影響從而完成肝再生啟動。在多種促

3、有絲分裂因子如肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-a)等，以及輔有絲分裂因子去甲腎上腺素和胰島素等的共同作用下促使肝細(xì)胞進(jìn)入增殖階段，進(jìn)行細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞有絲分裂。相關(guān)基因如c-myc、β-Catenin等，一些microRNA如miR-378、miR-221、miR-21等參與了這個復(fù)雜過程，但是對肝再生的分子機(jī)理，尤其是肝再生啟動、終止和重塑階段的機(jī)制仍不清楚。全面闡釋肝再生過程中的調(diào)控機(jī)制，

4、揭示肝再生過程中調(diào)控的關(guān)鍵分子，是研究肝細(xì)胞再生機(jī)制的關(guān)鍵科學(xué)問題。
　　 隨著短鏈非編碼RNA（如microRNA）研究的深入，和一些新的克隆、測序和芯片(tiling array)技術(shù)的應(yīng)用，大量長片段的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)，他們在生命活動中的重要意義逐漸被揭示。目前，將這一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的ncRNA稱為長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)，哺乳動物基因組序列中4％-9％的序列產(chǎn)生

5、的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA（相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例是1％）。已有的研究顯示，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾及核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用。如lincRNA-p21可被p53轉(zhuǎn)錄活化，并且可影響眾多p53靶基因的表達(dá)，在p53信號通路中起著重要的作用。Zhu等鑒定的膀胱癌中的一個長鏈非編碼RNA-ncRAN在膀胱癌中高表達(dá)，并且和膀胱癌的侵襲、分期相關(guān)。在前期研

6、究中本課題組利用肝癌與癌旁組織lncRNA芯片，鑒定出lncRNA-HEIH在肝癌組織中高表達(dá)，并且和病人預(yù)后成負(fù)相關(guān)，過表達(dá)lncRNA-HEIH可促進(jìn)肝癌的生長。但哪些lncRNA參與了肝再生過程還未見報道。
　　 第一部分H19通過形成myc相關(guān)的自反饋環(huán)路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖
　　 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力

7、的重要生物學(xué)過程，也是參與肝臟損傷修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，肝再生過程中內(nèi)皮細(xì)胞分泌的肝生長因子HGF可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，新近的研究發(fā)現(xiàn)肝再生過程中存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)的平衡，特定類型的上皮細(xì)胞發(fā)生EMT從而獲得間質(zhì)表型，一些上皮來源的間質(zhì)細(xì)胞通過產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致肝的纖維化;但是另一些能夠經(jīng)過其反過程MET，重新轉(zhuǎn)變成上皮細(xì)胞，最終形成肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞，導(dǎo)致?lián)p傷肝臟的正常修復(fù)，因此

8、研究肝再生過程中調(diào)控肝細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的新分子及其作用機(jī)制，對理解肝再生損傷修復(fù)的過程的分子機(jī)制有理論意義。但目前哪些lncRNA通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而參與了肝再生過程還未見報道。
　　 H19是一個已知的長2.3kb的非編碼RNA分子，其母系等位基因表達(dá)，父系印跡，在哺乳動物中呈現(xiàn)進(jìn)化上的保守性，是最早被鑒定的印跡基因之一。近年發(fā)現(xiàn)H19可以通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用，但目前H19調(diào)控肝

9、再生的機(jī)制還尚不明確。
　　 因此本課題建立小鼠肝大部分切除的肝再生模型，發(fā)現(xiàn)了在肝再生過程中發(fā)揮重要作用的已知長鏈非編碼RNA H19。揭示了H19在肝再生過程中的調(diào)控機(jī)制:H19的5'端可與hnRNP U蛋白相互作用，并且增強(qiáng)了下游c-myc mRNA的穩(wěn)定性使之上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖能力。同時，c-myc可以與H19的啟動子區(qū)結(jié)合從而促進(jìn)了H19的上調(diào)表達(dá)，形成H19的自反饋環(huán)路。H19/hnRNP U/c-my

10、c調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過調(diào)控EMT過程增強(qiáng)了H19在肝再生過程中促進(jìn)肝細(xì)胞增殖能力的作用。
　　 第二部分lncRNA-LALR1通過激活Wnt/β-Catenin信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖
　　 Wnt/β-Catenin信號通路在眾多組織中是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移的重要通路，在許多組織的損傷修復(fù)中都發(fā)現(xiàn)存在Wnt/β-Catenin信號通路的活化，并且這種活化與組織損傷修復(fù)能力和成瘤傾向有關(guān)。在肝臟中，越來越多的證據(jù)表明Wnt/

11、β-Catenin信號通路在肝臟的各種生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究表明，Wnt/β-Catenin信號通路對于肝切除術(shù)后的肝臟再生至關(guān)重要。但是哪些lncRNAs通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖及肝臟的再生依然尚未明確。
　　 因此本課題建立小鼠肝大部分切除的肝再生模型，通過lncRNA芯片篩選得到在肝再生過程中發(fā)揮重要作用的lncRNA-LALR1。揭示了lncRNA-LALR1在肝再生

12、過程中的調(diào)控機(jī)制:在肝再生過程中，肝生長因子HGF上調(diào)，增加了lncRNA-LALR1表達(dá)。lncRNA-LALR1通過招募轉(zhuǎn)錄因子CTCF到AXIN1的啟動子區(qū)抑制了Axin1的表達(dá)，激活了Wnt/β-Catenin信號通路，上調(diào)了cyclin D1的表達(dá)，加速了肝細(xì)胞G1期進(jìn)程，縮短了細(xì)胞周期，促進(jìn)了肝細(xì)胞增殖和肝臟再生。并在肝臟移植、各種肝病及肝腫瘤病人的組織中檢測lncRNA-LALR1表達(dá)量，期望lncRNA-LALR1可能成