急性ITP Th細(xì)胞極化狀態(tài)及PPAR-γ在Th細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 1.探討急性ITP是否為Th1/Th2細(xì)胞失衡相關(guān)的自身免疫病。研究急性ITP患者外周血中Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子INF-γ、IL-2、IL-10和IL-13的水平,Th細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA的表達(dá)情況,探討急性ITP的Th細(xì)胞的偏移方向。
　　 2.探討急性ITP患兒外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ mRNA表達(dá)的變化與IL-2、IL-13的相關(guān)性,分析PPAR-γ在急性ITP發(fā)病機(jī)制

2、中對(duì)IL-2、IL-13的作用。
　　 3.探討配體活化的PPAR-γ對(duì)Jurkat T細(xì)胞NO/NOS表達(dá)的影響,分析其與調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞失衡之間具體的作用機(jī)制。
　　 4.為臨床上治療急性ITP提供新的藥物和靶點(diǎn)提供理論依據(jù),并可能為臨床上治療其它Th1/Th2細(xì)胞分化失衡的自身免疫性疾病提供新的思路。
　　 [方法]
　　 1.外周血T淋巴細(xì)胞的分離
　　 取急性ITP患者及正常對(duì)照體

3、檢者外周靜脈血,枸椽酸鈉抗凝。淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞,置玻璃培養(yǎng)皿中孵育去除單核細(xì)胞,加入NH4Cl溶液溶解紅細(xì)胞,經(jīng)T細(xì)胞分離富聚柱獲得純化的T細(xì)胞。加入10％新生牛血漿Hanks液重懸T細(xì)胞,調(diào)整T細(xì)胞濃度至2×106/ml。FITC標(biāo)記的抗CD3單克隆抗體檢測(cè)其純度,臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)其活性。
　　 2.Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IL-13、INF-γ含量的檢測(cè)
　　 酶聯(lián)免疫

4、吸附試驗(yàn)法(ELISA)測(cè)定血漿中INF-γ、IL-2、IL-10和IL-13的水平,按試劑盒說明書操作,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以450nm比色,測(cè)吸光度(OD)值,以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣本濃度,以pg/ml表示。
　　 3.PPAR-γ mRNA的檢測(cè)
　　 T淋巴細(xì)胞懸液抽提總RNA,一步法特異性擴(kuò)增PPAR-γ mRNA,以β-actin為內(nèi)參,瓊脂糖凝膠電泳RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物,采用凝膠成像系統(tǒng)掃描PPAR-γ/β-ac

5、tin mRNA的條帶,測(cè)得條帶灰度值,以PPAR-γ/β-actin的灰度比值表示其mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。
　　 4.PPAR-γ活化劑調(diào)節(jié)對(duì)NO/NOS的作用研究
　　 Jurkat T細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)。PHA(5μg/ml)活化Jurkat T細(xì)胞24h后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml,培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。(1)時(shí)間效應(yīng):分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)5個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組加入20umol

6、/l藥物羅格列酮,對(duì)照組不加藥物,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h、12h、18h、24h和30h。(2)濃度效應(yīng):隨機(jī)分六組(對(duì)照組和1umol/l、5umol/l、10umol/l、15umol/l、20umol/l羅格列酮實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)5個(gè)重復(fù)),對(duì)照組不加藥物,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。
　　 5.Jurkat T細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平的檢測(cè)
　　 收集細(xì)胞培養(yǎng)液離心沉淀,勻漿后取上清液,按照硝酸還原酶法測(cè)量NO含量。
　

7、　 6.Jurkat T細(xì)胞中NOS活性的測(cè)定
　　 嚴(yán)格按照一氧化氮合酶測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作,最后測(cè)各管的吸光度值,利用計(jì)算公式計(jì)算出總NOS的活性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.分離純化所得T淋巴細(xì)胞的純度和活性均大于95%。
　　 2.與正常對(duì)照組相比,急性ITP患者外周血INF-γ含量降低,IL-10含量升高;T-bet mRNA表達(dá)下降,而GATA-3 mRNA表達(dá)增強(qiáng),Th1/Th2細(xì)胞因

8、子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)比例明顯降低。
　　 3.急性ITP患兒外周血淋巴細(xì)胞PPAR-γ mRNA表達(dá)上升,血漿IL-2的含量顯著低于正常對(duì)照組、而IL-13的含量顯著高于正常對(duì)照組,PPAR-γ mRNA表達(dá)與血漿IL-2水平呈負(fù)相關(guān),與IL-13水平呈正相關(guān)。
　　 4.在Jurkat系T細(xì)胞內(nèi),PPAR-γ活化劑能夠以時(shí)間和濃度依賴的形式增加NO生成,PPAR-γ活化劑能夠以相同的方式增加NOS活性。