Th22細(xì)胞在肝癌惡性腹水中募集和分化機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究輔助性 T淋巴細(xì)胞-22（Th22）細(xì)胞在惡性腹水（MA)及同源外周血中的分布情況及其表型特征，探討Th22細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的分化過程和其募集浸潤(rùn)至腹腔積液的機(jī)制。
　　方法:使用標(biāo)準(zhǔn)腹腔穿刺取得37例肝癌并發(fā)惡性腹水患者腹腔積液800 ml，并同時(shí)抽取外周血標(biāo)本15ml，納入病例均不曾接受抗腫瘤治療，未使用糖皮質(zhì)激素和甾體類抗炎藥。抽取10例健康對(duì)照者15ml外周血，使用密度梯度離心法獲得淋巴細(xì)胞并立即檢測(cè)T細(xì)胞亞群

2、Th17、Th22細(xì)胞在MA和外周血中的分布比例。使用人抗CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR10、CD45RA、CD45RO、CD62L單克隆抗體對(duì)Th22細(xì)胞膜表面染色標(biāo)記，破膜劑破膜后使用抗IL-22、抗 IL-17和IFN-γ單克隆抗體對(duì)Th22細(xì)胞內(nèi)抗原做熒光染色標(biāo)記。使用 Na?ve CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒從MA和外周血中陰性分選出CD4+T細(xì)胞，24孔板中單獨(dú)或組合加入外源性細(xì)胞因子：TNF-α（

3、50 ng/ml）、IFN-γ（50 ng/ml）、IL-1β（20 ng/ml）、IL-6（100 ng/ml），在37℃、5％CO2下培養(yǎng)7d后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IL-22染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Th22細(xì)胞比例，TNF-α+IL-6條件下刺激7組初始CD4+T細(xì)胞分化，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)0~7天，每天檢測(cè)一組Th22細(xì)胞比例；在TNF-α50 ng/ml濃度下，向5組初始CD4+ T細(xì)胞中加入5種不同濃度（0ng/ml、5 ng

4、/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）刺激，7 d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th22細(xì)胞比例。在外周血中提取初始CD4+T細(xì)胞，加入趨化小室上層，下層加入離心提取凍存的MA上清液，培養(yǎng)后收集下層小室細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IL-22染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞比例。將外周血中分選出的初始CD4+T細(xì)胞加入上層趨化小室。在下層加入之前離心提取凍存的MA上清液并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中3h。收集下層小室細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行細(xì)

5、胞內(nèi)IL-22染色，使用流式細(xì)胞儀分析。部分實(shí)驗(yàn)組加入抗CC類趨化因子20（CCL20）、抗 CCL22、抗 CCL27單克隆抗體100 ng/ml，或三者組合以期阻斷趨化效應(yīng)，使用流式細(xì)胞儀分析Th22比例，計(jì)算趨化指數(shù)。
　　結(jié)果：MA中Th22細(xì)胞的比例(3.22%±0.4%,n=37)明顯高于對(duì)應(yīng)外周血(0.79%±0.2%，n=37，P<0.01)和健康對(duì)照組(0.63%±0.11%，n=10，P<0.01），Th17細(xì)

6、胞在MA中比例(3.30%±0.18%)也明顯高于對(duì)應(yīng)外周血(0.79%±0.15%，n=37，P<0.01)及健康對(duì)照組（0.67±0.12%，n=10，P<0.01)，且兩種細(xì)胞比例呈正相關(guān)（P<0.01）。MA和外周血中的Th22細(xì)胞表達(dá)CD45RA（10.51%±0.72%vs18.20%±0.78%，P<0.01）、CD62L（7.05%±0.49%vs13.66%±0.68%，P<0.01）、CCR3（5.77%±0.50%

7、vs5.51%±0.53，P>0.05）、CCR5（9.21%±0.82%vs10.84%±0.71，P<0.01）水平較低，CD45RO（83.34%±0.96%vs80.08%±1.14%，P<0.01）、表達(dá)水平較高。較高水平表達(dá)CCR4（72.48%±1.74%vs68.70%±1.61，P>0.05）、CCR6（83.88%±1.68%vs85.61%±1.61，P>0.05）、CCR10（88.13%±1.24%vs89.2

8、3%±1.31，P>0.05），CCR7為（52.61%±2.67%vs42.33%±2.44%，P<0.05）。CD4+T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化過程中，白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β起促進(jìn)分化作用，干擾素-γ（IFN-γ）起抑制分化作用，且Th22細(xì)胞受IL-6的促分化作用呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴規(guī)律。MA上清液對(duì)外周血Th22細(xì)胞有明顯的趨化效應(yīng)，加入抗 CCL20、抗 CCL22、抗CCL27單克隆抗