2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、肝纖維化發(fā)病過程以細(xì)胞外基質(zhì)異常增生和過度沉積為特征,機(jī)體的免疫系統(tǒng)在其中也扮演著重要角色。Th22細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T輔助細(xì)胞亞群,以分泌IL-22為特征。研究表明,Th22細(xì)胞參與了人和動(dòng)物多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均提示Th22細(xì)胞亞群及其效應(yīng)分子IL-22可能參與了肝纖維化的發(fā)病過程。但在肝纖維化發(fā)病過程中Th22細(xì)胞的變化規(guī)律如何?相關(guān)細(xì)胞因子變化及其相互關(guān)系如何?目前無相關(guān)研究。為進(jìn)一步了解

2、Th22細(xì)胞在肝纖維化發(fā)病過程中的變化,闡明Th22細(xì)胞及IL-22在肝纖維化中的作用、尋求肝纖維化新的治療,本課題應(yīng)用BALB/C小鼠腹腔注射CCL4建立肝纖維化小鼠模型,及予IL-22干預(yù)肝星狀細(xì)胞,進(jìn)行以下三方面研究。
  第一部分 Th22及相關(guān)因子在肝纖維化小鼠中的動(dòng)態(tài)變化
  目的:觀察小鼠肝纖維化發(fā)病過程中Th22細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-22、IL-17A、IFN-γ、 IL-6和TNF-α的動(dòng)態(tài)演變,探討T

3、h22細(xì)胞及其細(xì)胞因子在肝纖維化中的作用及意義。
  方法:雄性Balb/c小鼠72只,體重22~25g,隨機(jī)(按隨機(jī)數(shù)字表法)分為模型組(n=40)和對照組(n=32)。兩組小鼠均設(shè)0(注射前)、4、8、12周4個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組,模型組的每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組10只。對照組的每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組8只。對照組腹腔內(nèi)注射橄欖油,2 mg/kg體重,每周2次;模型組腹腔內(nèi)注射CCL4,濃度20%,2 mg/kg體重,每周2次,各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)處死;HE和M

4、asson染色觀察小鼠肝臟病理改變并根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)評估肝纖維化的程度;免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)及IL-22的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)(FCS)檢測小鼠脾Th22細(xì)胞數(shù)變化、RT-PCR檢測肝臟組織Th22相關(guān)細(xì)胞因子IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá), ELISA檢測血漿中IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和

5、TNF-α蛋白的表達(dá)。
  結(jié)果:(1)肝組織病理切片HE染色顯示:隨著造模時(shí)間的延長,肝細(xì)胞變性、壞死,逐漸形成纖維間隔,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,最終形成假小葉。Masson染色鏡下觀察可見模型組的肝組織匯管區(qū)、中央靜脈大量膠原纖維沉積,肝小葉被寬窄不一的纖維間隔分割。(2)免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示:隨造模時(shí)間的延長,模型組α-SMA表達(dá)量逐漸增加,除0周時(shí)點(diǎn)外,模型組其他時(shí)點(diǎn)α-SMA蛋白表達(dá)量均高于對照組(P<0.01)。(3)

6、流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示:模型組小鼠第4周時(shí)脾臟Th22細(xì)胞比例開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時(shí)點(diǎn)外,模型組Th22細(xì)胞比例均高于對照組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.01)。(4)模型組小鼠第4周時(shí)肝臟組織IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時(shí)點(diǎn)外,模型組的肝組織IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量均高于對照組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.0

7、1)。(5)模型組小鼠第4周時(shí)外周血IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)量開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時(shí)點(diǎn)外,模型組的外周血IL-22、IL-17A、IFN-γ、 IL-6和TNF-α的表達(dá)量均高于對照組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.01)。(6)模型組小鼠第4周時(shí)肝臟組織IL-22蛋白的表達(dá)量開始升高,并一直持續(xù)至12周。除0周時(shí)點(diǎn)外,模型組的肝組織IL-22的表達(dá)量均高于對照組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.01)

8、。
  結(jié)論:Th22及相關(guān)細(xì)胞因子在肝纖維化小鼠中呈高表達(dá)。
  第二部分 重組IL-22抑制小鼠肝纖維化的體內(nèi)研究
  目的:觀察體內(nèi)重組IL-22對肝纖維化小鼠的干預(yù)作用,從而進(jìn)一步確定Th22細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-22在肝纖維化中的作用。
  方法:6周齡雄性BABL/c小鼠16只均腹腔注射20%CCL4,每周2次,在造模后第8周起,隨機(jī)分成2組:重組IL-22組(n=8,rmIL-22組)和對照組(n=

9、8,carrier組)。重組IL-22和carrier組小鼠分別腹腔注射0.3μg/grmIL-22和等體積溶劑0.5% BSA(in PBS, pH7.0),每天1次,一直到第10周。第10周時(shí)處死小鼠,并收集外周血、血漿、脾臟及肝臟組織等標(biāo)本;HE和Masson染色了解肝臟病理改變及根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)評估肝纖維化的程度;免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)和IL

10、-22的表達(dá);RT-PCR檢測小鼠肝臟組織IL-22、IL-22R1、IL-10R2、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá),ELISA檢測血漿中IL-22、 IL-17A、 IFN-γ、 IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)、FCS檢測兩組小鼠脾臟Th22細(xì)胞數(shù)變化。
  結(jié)果:(1)與對照組相比,重組IL-22可改善肝纖維化小鼠的肝纖維化程度、降低肝纖維化病理積分,減少肝臟中α-SMA蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

11、(2)與對照組相比,重組IL-22降低脾Th22亞群細(xì)胞的增殖,同時(shí)減少小鼠肝臟組織中IL-22蛋白和血漿中IL-22蛋白的水平,并降低肝臟組織IL-22、IL-22R1和IL-10R2mRNA的表達(dá)(P<0.05)。(3)與對照組相比,重組IL-22降低小鼠血漿中IL-17A、 IFN-γ、TNF-α和IL-6蛋白的水平及降低肝臟組織IL-17A、 IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。
  結(jié)論:

12、IL-22通過抑制HSC活性及炎癥因子改善肝纖維化。
  第三部分 重組IL-22抑制肝星狀細(xì)胞增殖的體外研究
  目的:研究重組IL-22對肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖和活化的影響及其對纖維化相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用。
  方法:將SD大鼠原代肝星狀細(xì)胞(HSCs)分為3組,①對照組:HSCs單獨(dú)培養(yǎng);②實(shí)驗(yàn)組a:重組IL-22(10ng/ml)干預(yù)HSCs;③實(shí)驗(yàn)組b:重組IL-22(20ng/ml)干預(yù)HSCs。各組分別

13、培養(yǎng)24h、48h和72h,于倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;免疫組化法檢測HSCs中α-平滑肌蛋白(α-SMA)的表達(dá)量;四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測IL-22對HSCs的最佳干預(yù)濃度;熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測HSCs中α-SMA、TGF-β1和TIMP-1 mRNA的表達(dá)水平。
  結(jié)果:1.倒置相差顯微鏡下觀察,可見狀態(tài)良好的HSCs呈膜狀生長,呈典型的星形或多邊形,胞內(nèi)較多顆粒。免疫組織

14、化學(xué)染色法結(jié)果顯示:培養(yǎng)48h的HSCs可見胞漿內(nèi)棕黃色顆粒,即α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽性,95%以上的活化的HSCs呈陽性表達(dá)。2.與對照組相比,不同濃度的IL-22在24h、48h和72h后對肝星狀細(xì)胞均有抑制作用(P<0.05),濃度為20 ng/ml時(shí)肝星狀細(xì)胞的抑制作用最明顯,與其他各濃度比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P<0.05)。3.實(shí)驗(yàn)組的α-SMA、TGF-β1和TIMP-1mRNA表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而降低,比對照組的相應(yīng)時(shí)

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