IL-22與miR-200a交互作用抑制肝纖維化的研究.pdf

1、肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑，以細(xì)胞外基質(zhì)異常增生和在肝內(nèi)過量沉積為病理特征。肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellate cells，HSCs)的異常激活和分泌致纖維化因子是肝纖維化發(fā)生的重要原因。研究表明，多種細(xì)胞因子和miRNAs在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色。IL-22可由多種免疫細(xì)胞分泌，通過與細(xì)胞表面的IL-22受體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transd

2、ucerand activator of transcription，STAT)發(fā)揮調(diào)控作用。miRNAs通過與靶mRNA完全或不完全配對形成沉默復(fù)合體，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因轉(zhuǎn)錄進行負(fù)調(diào)控。miR-200a在肝纖維化患者和大小鼠肝纖維模型中均表達(dá)下調(diào)，并通過抑制靶基因發(fā)揮抑制HSCs活性的作用。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)IL-22可以抑制HSCs活性和發(fā)揮抗小鼠肝纖維化作用，但I(xiàn)L-22是否與miR-200a有交互作用關(guān)系？如果有，相關(guān)細(xì)胞因子變

3、化及其相互關(guān)系如何？目前無相關(guān)研究。為進一步了解IL-22和miR-200a在抗肝纖維化作用的機制，并闡明IL-22和miR-200a在肝纖維化中的交互作用(cross-talk)關(guān)系，進而探索出肝纖維化新的治療靶點，本研究應(yīng)用大鼠HSCs和肝纖維化模型，分別給予IL-22和miR-200a干預(yù)，檢測相關(guān)下游因子的改變情況，觀察兩者在HSCs和肝纖維化模型中的交互作用。本研究將從以下三方面進行研究:
　　第一部分 IL-22經(jīng)ST

4、AT3通路抑制HSCs活性和抗肝纖維作用研究
　　目的:
　　觀察IL-22干預(yù)HSCs后，細(xì)胞活性的改變情況，并觀察IL-22對大鼠肝纖維化模型的作用，探討IL-22抑制HSCs活性和抗肝纖維作用的機制。
　　方法:培養(yǎng)大鼠HSCs細(xì)胞系(HSCs-T6)至對數(shù)生長期，分別使用250pg/mL、500pg/mL、750pg/mL和1000pg/mL濃度的IL-22加入培養(yǎng)基中干預(yù)48小時;分別采用0、2、5ng/mL

5、濃度的TGF-β1加入培養(yǎng)基24小時激活HSCs;CCK8法檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，EHSA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和膠原蛋白Ⅰ(ColⅠ)表達(dá)水平，westem-blot法檢測細(xì)胞中的STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平;采用CCL4腹腔注射大鼠8周構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，在給予IL-22腹腔注射1周，處死大鼠，收集肝臟組織，HE和Masson

6、染色觀察小鼠肝臟病理改變，根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)評估肝纖維化的程度;免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織中α-SMA，westem-blot法檢測肝組中的STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　隨著IL-22濃度的升高，HSCs增殖率下降，到750 pg/mL時，與無IL-22干預(yù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。但隨著IL-22濃度的升高，HSCs凋亡率無顯著改變。ELIAS法檢測培養(yǎng)上清液中的α-SMA和C

7、olⅠ隨著IL-22濃度的升高而下降，到750pg/mL時，α-SMA水平與無IL-22干預(yù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);隨著TGF-β1濃度的升高，HSCs增殖率上升，到5 ng/mL時，HSCs的增殖率與無TGF-β1干預(yù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。STAT3蛋白表達(dá)水平隨著TGF-β1濃度的升高無顯著改變，而p-STAT3蛋白表達(dá)水平隨著TGFβ1濃度的升高而下降，到5ng/mL時，p-STAT3蛋白表達(dá)水平比無

8、TGF-β1干預(yù)時顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);采用TGF-β1預(yù)處理HSCs，再使用IL-22分別干預(yù)后，STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著改變，而p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05);大鼠模型實驗中，與未進行IL-22干預(yù)相比，IL-22干預(yù)后，大鼠肝纖維化明顯改善，肝臟Ishak組織學(xué)評分顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，肝組織中的STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著改變，而p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著上升（P

9、＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　IL-22以濃度依賴性抑制HSCs增殖和活性，但對HSCs凋亡無顯著影響;IL-22可以有效的抑制HSCs活性和抗肝纖維化作用，其機制是通過激活STAT3磷酸化信號通路表達(dá)實現(xiàn)的。
　　第二部分 miR-200a靶向β-catenin抑制HSCs增殖與活性
　　目的:
　　檢測miR-200a在HSCs和肝纖維化組織的表達(dá)情況，并觀察過表達(dá)miR-200a對HSCs的影響;驗

10、證miR-200a對β-catenin直接調(diào)控作用，并在HSCs驗證，闡明miR-200a靶向β-catenin抑制HSCs增殖與活性的機制。
　　方法:
　　培養(yǎng)HSCs至對數(shù)培養(yǎng)期，分別采用0、5ng/mL濃度的TGF-β1加入培養(yǎng)基中干預(yù)24小時，采用熒光定量PCR法檢測HSCs中的miR-200a表達(dá)情況;采用慢病毒包裝的miR-200a mimics轉(zhuǎn)染HSCs，觀察過表達(dá)HSCs中的miR-200a對HSCs的影

11、響;CCK8法檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的α-SMA表達(dá)水平，western-blot法檢測細(xì)胞中的β-catenin蛋白表達(dá)水平。使用在線數(shù)據(jù)庫Targetscan預(yù)測miR-200a的靶基因，在使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-200a對β-catenin直接調(diào)控作用，
　　結(jié)果:
　　TGF-β1激活后，HSCs中的miR-200a表達(dá)水平顯著下降，與無TGF-β1激活相比

12、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。使用慢病毒包裝的大鼠miR-200amimics培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染HSCs，與未進行miR-200a轉(zhuǎn)染的HSCs相比，轉(zhuǎn)染了miR-200a的HSCs中，miR-200a表達(dá)升高打8倍以上;CCK8法發(fā)現(xiàn)HSCs增殖率下降，與未進行miR-200a mimics相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ELIAS法發(fā)現(xiàn)miR-200amimics轉(zhuǎn)染后，HSCs培養(yǎng)上清液中的α-SMA水平下降，與未進行miR-2

13、00amimics相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。雙熒光素酶系統(tǒng)顯示轉(zhuǎn)染了miR-200amimics和β-catenin質(zhì)粒后，細(xì)胞中的熒光素酶活性顯著下降(P＜0.05);western-blot法顯示HSCs轉(zhuǎn)染miR-200amimics后，細(xì)胞中的β-catenin蛋白表達(dá)水平下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　miR-200a在HSCs激活過程中表達(dá)下降，過表達(dá)miR-200a可以抑制HSCs增殖和活性

14、;雙熒光素酶系統(tǒng)驗證了β-catenin是miR-200a的直接靶基因;miR-200a通過靶向調(diào)控β-catenin抑制HSCs增殖和活性。
　　第三部分 IL-22與m i R-200a在HSCs和肝纖維組織中交互作用研究
　　目的:
　　觀察IL-22干預(yù)HSCs和大鼠肝纖維化模型以及抑制miR-200a后，HSCs和肝纖維化組織中的IL-22和miR-200a下游因子的表達(dá)情況，闡明IL-22與miR-200a

15、在HSCs和肝纖維組織中交互作用機制。
　　方法:
　　IL-22干預(yù)HSCs后細(xì)胞，熒光定量PCR和westem-blot分別檢測細(xì)胞中miR-200a和β-catenin表達(dá)的情況;慢病毒轉(zhuǎn)染miR-200a inhibitors至HSCs，抑制HSCs中的miR-200a表達(dá)，再給予IL-22干預(yù)，觀察抑制miR-200a后，IL-22對HSCs的影響，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的α-SMA表達(dá)水平;western

16、-blot法檢測細(xì)胞中的STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平。采用CCL4腹腔注射大鼠4周構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，在給予IL-22腹腔注射，同時給予尾靜脈注射慢病毒包裝的miR-200a inhibitors，1周后處死大鼠，收集肝臟組織，抑制大鼠肝纖維化模型中的miR-200a，HE和Masson染色觀察小鼠肝臟病理改變并根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)評估肝纖維化的程度;免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟組織中α-SMA，western-blot法檢測

17、肝組中的β-catenin、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平，觀察抑制miR-200a后，IL-22對大鼠肝纖維化的影響;
　　結(jié)果:
　　TGF-β1加入培養(yǎng)基中激活HSCs活性，在給予IL-22干預(yù)，發(fā)現(xiàn)與未進行IL-22干預(yù)相比，IL-22干預(yù)后HSCs中的miR-200a水平上升，而β-catenin蛋白水平下降;轉(zhuǎn)染了miR-200a inhibitors的HSCs中β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P

18、＜0.05)，STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著改變，但p-STAT3的蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）;大鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功后，分為IL-22和miR-200a inhibitors單獨注射組和IL-22+ miR-200a inhibitors注射組，轉(zhuǎn)染了miR-200a inhibitors的肝組織中的miR-200a表達(dá)比未轉(zhuǎn)染miR-200a inhibitors的低，IL-22的抗肝纖維化作用被miR-200a inhi

19、bitors抑制，而β-catenin蛋白表達(dá)水平也較升高(P＜0.05)，STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著改變，但p-STAT3的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　IL-22可以上調(diào)HSCs中的miR-200a表達(dá)量，進而下調(diào)β-catenin表達(dá)水平;抑制miR-200a表達(dá)量可以抑制IL-22對HSCs的作用，并抑制STAT3磷酸化水平;IL-22改善大鼠肝纖維化作用可被miR-200a inhibi