小鼠宮內(nèi)移植腹水型惡性腫瘤細(xì)胞H-,22-和S-,180-的實驗研究.pdf

1、癌癥是“世紀(jì)之魔”、是嚴(yán)重威脅人類健康的“第一殺手”。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，當(dāng)今世界每隔6秒就有一個生命被癌癥奪去。隨著工業(yè)化、居住城市化、人口老齡化進(jìn)程的加快，以及環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，癌癥發(fā)病率今后還會持續(xù)上升。盡管人類對腫瘤和發(fā)育的認(rèn)識由來已久，人類也已步入了后基因組以及各種實驗技術(shù)的迅速發(fā)展和應(yīng)用的時代，但是由于缺乏對腫瘤發(fā)生機(jī)理的全面了解，使人們對大多數(shù)嚴(yán)重威脅自身生命質(zhì)量(1ifequality)和生存的惡性腫瘤仍然束手無策；與

2、此同時，雖然人們對個體發(fā)育的認(rèn)識已經(jīng)滲入到了基因水平，但對于個體的發(fā)生、發(fā)育現(xiàn)象仍存在許多未解的難題，人類對自身的認(rèn)識——個體發(fā)育的許多問題仍處于探索階段。 早在1829年Lobstein等就提出了腫瘤的胚胎性起源概念，但直到上世紀(jì)七十年代癌基因研究的興起才使得這一理論被重新理解和深入，早期胚胎細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的相似性研究日益受到重視；越來越多的學(xué)者認(rèn)為不同胚胎微環(huán)境(包括卵母細(xì)胞，囊胚和部分妊娠中、晚期胎兒)可能對

3、攜帶全套遺傳信息的細(xì)胞核有“程序重排作用”(reprogramme)而使某些惡性腫瘤細(xì)胞的表型逆轉(zhuǎn)。在九十年代初期，中國和印度等一些國家進(jìn)行了將引產(chǎn)胎兒的脾細(xì)胞等輸入晚期惡性腫瘤患者的臨床治療觀察，發(fā)現(xiàn)能部分延緩患者的生存期，從臨床方面也為這一理論提供了重要證據(jù)。 我們實驗室課題組在建立小鼠囊胚一惡性腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上觀察到了已經(jīng)分化決定的正常細(xì)胞一囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞在體外能“侵襲”不同侵襲潛能的惡性腫瘤細(xì)胞，并形成類似“青

4、霉菌抑菌圈樣”的無腫瘤細(xì)胞生長空白帶；一定劑量的抗植入藥米非司酮能有效抑制高轉(zhuǎn)移潛能的小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移率和降低腫瘤的血管生成能力。為了探討胚胎與腫瘤在體內(nèi)的相互作用，本實驗研究在我們已有的實驗研究及其對早期胚胎發(fā)育與惡性腫瘤相互作用研究的深刻理解基礎(chǔ)上，選擇腹水型惡性腫瘤細(xì)胞，著眼于中、晚期的胚胎微環(huán)境與惡性腫瘤細(xì)胞的實驗研究，旨在進(jìn)一步認(rèn)識惡性腫瘤存在于胚胎微環(huán)境中的生長行為及其對胚胎發(fā)育的影響和惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，為理解生命現(xiàn)象

5、的個體發(fā)育和惡性腫瘤生物學(xué)行為的內(nèi)涵提供原始的實驗依據(jù)和技術(shù)平臺，為胚胎微環(huán)境逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞表型提供進(jìn)一步的證據(jù)，推進(jìn)人類對胚胎與惡性腫瘤相互作用的理解和認(rèn)識。 目的 1自我構(gòu)建和自我組織是個體發(fā)育的基本原則，而基因水平的重組和細(xì)胞的社會性是闡釋有機(jī)體復(fù)雜發(fā)育模式的重要觀點，惡性腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境對其發(fā)生、發(fā)展有重要影響。細(xì)胞的行為模式不僅受基因等內(nèi)在因素的影響，還受到鄰近細(xì)胞的能量流和信息流的制約，在發(fā)育晚期，還受

6、到機(jī)體外部的影響。通過選擇小鼠中晚期胚胎羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13一D21)為胚胎微環(huán)境，采用宮內(nèi)移植的方法使惡性腫瘤細(xì)胞與發(fā)育中的胚胎“共處一室”，探討惡性腫瘤細(xì)胞對胚胎發(fā)育的影響，以及胚胎微環(huán)境對惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從細(xì)胞社會學(xué)和個體發(fā)育微環(huán)境等方面研究惡性腫瘤細(xì)胞與胚胎的相互作用。 2利用全胚胎培養(yǎng)技術(shù)，初步探討惡性腫瘤細(xì)胞上清液對胚胎的發(fā)育毒性，從體外和單因素的角度來直接觀察惡性腫瘤細(xì)胞對胚胎發(fā)

7、育的影響。 3建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞株，采用細(xì)胞生物標(biāo)記的方法來初步研究移植到胚胎腹腔的惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，來初步實現(xiàn)實驗現(xiàn)象的機(jī)理探討和研究被移植惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。意義 1通過從胚胎發(fā)育生物學(xué)的角度認(rèn)識腫瘤以及對胚胎發(fā)育微環(huán)境與惡性腫瘤細(xì)胞相互作用的進(jìn)一步研究，有利于我們深入地理解胚胎和腫瘤兩種“正．邪”生命現(xiàn)象的內(nèi)涵，拓展胚胎與腫瘤相互作用研究的新領(lǐng)域，為“腫瘤的胚胎源性”學(xué)說提供新的理論依據(jù)

8、。 2通過從特殊移植物的選擇入手，對現(xiàn)有宮內(nèi)移植免疫理論提出問題，為宮內(nèi)移植免疫的深入研究提供一定實驗支持。 3通過在發(fā)育生物學(xué)和腫瘤學(xué)交叉領(lǐng)域研究的嘗試，為研究胚胎與腫瘤相互作用以及對生命現(xiàn)象本質(zhì)的認(rèn)識提供新的思維方法和探索方向，也對惡性腫瘤細(xì)胞的表型研究提供新的技術(shù)平臺。 4通過本研究的實踐，為人們試圖從個體生命現(xiàn)象本身中去尋求認(rèn)識腫瘤、征服腫瘤建立新的方法學(xué)。 材料與方法 1將6×106的H

9、22細(xì)胞和8180細(xì)胞采用宮內(nèi)移植的方法移植到NIH胎鼠的羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13-D18)，觀察移植H22細(xì)胞和S180細(xì)胞后的胎鼠分娩、新生鼠發(fā)育狀況和荷瘤情況。 2采用放射免疫法和RT-PCR觀察H22細(xì)胞標(biāo)記產(chǎn)物AFP的表達(dá)，探討移植腫瘤H22細(xì)胞后成年鼠微量荷瘤情況；采用兄妹間交配方法觀察雌鼠的妊娠能力，探討有無生殖系統(tǒng)荷瘤。 3采用體外全胚胎培養(yǎng)技術(shù)，觀察H22細(xì)胞和S180細(xì)胞上清液在體外對胚胎

10、的發(fā)育毒性，初步探討腫瘤細(xì)胞上清液在體外對小鼠器官形成期胚胎(D8．5胚胎)發(fā)育的影響。 4建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的gfp-H22和gfp-S180穩(wěn)定瘤株，采用雙熒光標(biāo)記法和激光共聚焦掃描技術(shù)，觀察H22細(xì)胞和S180細(xì)胞中PKC,PCNA,P53和MMP-2在移植于胎鼠腹腔后24h,48h,72h后的表達(dá)，初步探討被移植腫瘤細(xì)胞在胚胎腹腔微環(huán)境的細(xì)胞生物學(xué)行為。 結(jié)果 1被移植惡性腫瘤細(xì)胞胎鼠的發(fā)育

11、 通過羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13-D18)移植H22細(xì)胞和8180細(xì)胞的胎鼠能夠在D19-D21發(fā)育至順利分娩，新生鼠繼續(xù)發(fā)育至成年，其發(fā)育時序、生理指標(biāo)(包括各時期體重、平面翻正反射、耳廓分離、長出可見絨毛、懸崖回避、強(qiáng)握金屬線、聽覺驚愕、睜眼時間、睪丸下降、陰道開口及出毛)和正常對照組小鼠比較，未見異常；主要臟器肝、肺和腎臟組織切片HE染色、鏡下觀察，結(jié)構(gòu)完整、未見異常細(xì)胞和結(jié)構(gòu)。 2被移植惡性腫瘤細(xì)胞胎鼠發(fā)育至成

12、年的荷瘤狀況 羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13-D18)被移植H22細(xì)胞和8180細(xì)胞的胎鼠出生后發(fā)育未見異常而且在新生鼠至成年及長期觀察(最長已達(dá)260d)未見肉眼和解剖荷瘤。在移植H22細(xì)胞的實驗組和對照組血清中AFP值均顯著低于荷瘤對照(P<0．05)，但實驗組和正常對照組間AFP值無顯著性差異(P>0．05)；RT-PCR發(fā)現(xiàn)，AFP的DNA擴(kuò)增實驗組和正常對照組為陰性，荷瘤組為陽性。 3H22細(xì)胞和8180

13、細(xì)胞上清液對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響 H22細(xì)胞和S180細(xì)胞上清液在體外對小鼠胚胎有極強(qiáng)的發(fā)育毒性和致死性。 4小鼠宮內(nèi)移植后H22細(xì)胞和S180細(xì)胞的PCNA、PKC、P53和MMP-2表達(dá) H22細(xì)胞和S180細(xì)胞中PCNA、PKC、P53的表達(dá)隨著移植到胎鼠腹腔微環(huán)境后的時間增加明顯降低(P<0．05)，MMP-2無顯著想變化(P>0．05)。 結(jié)論 1建立小鼠宮內(nèi)移植惡性腫瘤H22細(xì)胞和S

14、180細(xì)胞的動物模型，采用胎鼠羊膜腔和腹腔注射是可行的。 2發(fā)育中的中、晚期胚胎小鼠的微環(huán)境(包括羊膜腔和腹腔)移植惡性腫瘤H22細(xì)胞和8180細(xì)胞后對胚胎發(fā)育無毒性作用；宮內(nèi)的胚胎微環(huán)境(包括羊膜腔和腹腔)通過程序重編作用逆轉(zhuǎn)了惡性腫瘤H22細(xì)胞和S180細(xì)胞的某些惡性表型，使其不干擾胚胎的整體發(fā)育和保持無瘤狀態(tài)。因此我們推測不僅是早期生命現(xiàn)象的胚胎微環(huán)境即卵母細(xì)胞和囊胚腔，而且宮內(nèi)中晚期的胚胎微環(huán)境即羊膜腔和腹腔也能夠抑制某

15、些惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和逆轉(zhuǎn)其部分惡性細(xì)胞表型。 3小鼠宮內(nèi)移植惡性腫瘤H22細(xì)胞和S180細(xì)胞對胎鼠無生殖毒性、無長期發(fā)育毒性和長期觀察無荷瘤，移植的惡性腫瘤細(xì)胞的部分固有惡性表型發(fā)生了改變，表現(xiàn)為：宮內(nèi)腹腔移植后H22細(xì)胞和S180細(xì)胞隨著移植時間的增加，PCNA、PKC和P53的表達(dá)減弱，而MMP-2的表達(dá)沒有明顯變化，推測宮內(nèi)的胚胎腹腔微環(huán)境可能逆轉(zhuǎn)了其部分惡性表型，使移植后的腫瘤細(xì)胞向低增殖高分化的趨勢發(fā)展，但其浸潤能力