聯(lián)合應(yīng)用反應(yīng)停與抗VEGF單抗靶向抑制荷H-,22-肝癌小鼠腫瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：依據(jù)靶向阻斷新血管生成可有效抑制腫瘤生長的原理，研究聯(lián)合應(yīng)用抗VEGF單抗與反應(yīng)停兩種抗血管生成藥對荷H22肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用，探討聯(lián)合應(yīng)用抗VEGF單抗與反應(yīng)停作為一種新型抗肝癌方式的可行性。
　　 方法：1.小鼠肝癌移植瘤模型的建立：60只純系清潔級KM小鼠，雌性，7～8周齡，體重18～22g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1d后，種植癌細(xì)胞，取小鼠左后肢大腿外側(cè)為種植點(diǎn)，抽取0.2ml腫瘤細(xì)胞懸夜（約含4×106個(gè)細(xì)胞）注入種植

2、點(diǎn)皮下。
　　 2.動(dòng)物分組及腫瘤生長觀察：腫瘤種植后1w，可觀察到全部小鼠有明顯皮下腫塊形成，第10日選取其中腫瘤生長良好腫塊直徑約5mm的小鼠40只，將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，即鹽水組（對照組），抗體組，反應(yīng)停組，抗體加反應(yīng)停組，每組10只。用游標(biāo)卡尺測量腫塊長徑（a）及橫徑（b），每日測量1次，腫瘤體積（V）=a×b2/2。
　　 3.藥物給予：腫瘤接種后10d即分組當(dāng)日開始給藥，對照組每日每只經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.2

3、ml；反應(yīng)停組灌胃反應(yīng)停400rag/（kg·d），灌胃容積為0.2ml/10g；抗體組每日每只經(jīng)尾靜脈注射抗VEGF單抗0.2ml；聯(lián)合組每日每只灌胃反應(yīng)停400mg/（kg·d），灌胃容積為0.2ml/10g，再經(jīng)尾靜脈注射抗VEGF單抗0.2ml。連續(xù)給藥12d。
　　 4.瘤體稱質(zhì)量：抗體給藥結(jié)束后繼續(xù)觀察腫瘤生長2w，于腫瘤種植后36d處死動(dòng)物，稱鼠重，取瘤組織，仔細(xì)分離腫塊周邊皮膚及非腫瘤組織，瘤體稱質(zhì)量并計(jì)算瘤質(zhì)量

4、抑制率，瘤質(zhì)量抑制率（％）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量）×100％。
　　 5.免疫組化微血管密度（MVD）測定：將腫瘤組織切成3mm厚片狀，40g/L甲醛固定24h，脫水石蠟包埋，切片厚5μm.免疫組化SABC法：一抗為多克隆兔抗鼠CD34抗體，工作濃度1：100稀釋.即用型High-SABC免疫組化試劑盒，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行，DAB染色，蘇木素復(fù)染，樹膠封片。選血管內(nèi)皮細(xì)胞染色密集區(qū)于高倍鏡（×200）下

5、計(jì)數(shù)染色細(xì)胞，每片計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值。
　　 6.免疫組化測VEGF表達(dá)：采用SABC法，組織切片脫蠟、水化后，用3％過氧化氫去除內(nèi)源性酶，微波抗原修復(fù)，然后加入兔抗人VEGF抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察結(jié)果。分別用已知陽性的肝癌組織切片作陽性對照，正常小鼠和兔血清及PBS代替-抗作陰性對照。細(xì)胞漿或核呈棕黃色顆粒狀分布者為陽性染色。陽性染色細(xì)胞≤10％者為陰性表達(dá)，細(xì)胞陽性染色>10％者為陽性表達(dá)。
　　

6、7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各項(xiàng)計(jì)量資料指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析處理腫瘤體積變化數(shù)據(jù)，多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)處理瘤質(zhì)量抑制數(shù)據(jù)、MVD及VEGF表達(dá)率數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：1.抗VEGF單抗與反應(yīng)停對腫瘤生長的抑制情況：種瘤后10d即動(dòng)物分組時(shí)各組腫瘤體積無顯著性差異，給藥6d后，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長呈現(xiàn)減慢趨勢，但各組差異

7、不顯著。種瘤后20d即給藥后10d，抗體組、反應(yīng)停組和聯(lián)合組腫瘤體積顯著小于對照組，且聯(lián)合組<抗體組<反應(yīng)停組，此顯著性差異一直持續(xù)至動(dòng)物處死（種瘤后36 d）。
　　 2.瘤質(zhì)量抑制率：反應(yīng)停組、抗體組和聯(lián)合組在動(dòng)物處死時(shí)的瘤質(zhì)量抑制率分別為15.84％，29.26％和41.77％，均有明顯抑制腫瘤質(zhì)量增長作用，聯(lián)合組瘤質(zhì)量明顯低于反應(yīng)停組和抗體組。
　　 3.腫瘤組織微血管測定（MVD）：免疫組化法處理結(jié)果顯示，各實(shí)

8、驗(yàn)組MVD低于對照組，聯(lián)合組較反應(yīng)停組與抗體組MVD低，MVD在抗體組與反應(yīng)停組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.VEGF表達(dá)率測定：免疫組化法處理結(jié)果顯示，各組VEGF表達(dá)率分別為：反應(yīng)停組45％、抗體組35％、聯(lián)合組25％，顯著低于對照組80％。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，雖然反應(yīng)停與抗VEGF單抗兩種藥物抗血管生成作用基理不同，但在抗H22轉(zhuǎn)移瘤新生血管生成上有協(xié)同作用，并且這兩種藥相對于腫瘤患者來說使用限制