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文檔簡介
1、胚胎干細胞(ESC)與誘導(dǎo)性多能干細胞(iPSC)由于具有自我更新和強大分化潛能,在心肌再生方面有著極大的應(yīng)用前景。與ESC不同,iPSC可以由病人的皮膚組織重編程獲取,經(jīng)過一系列誘導(dǎo)分化,有可能建立大批量同源心肌細胞而無倫理爭議和免疫排斥。因此,以iPSC高效誘導(dǎo)分化的心肌細胞替代活體心肌細胞作為種子細胞來源,采用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建心肌組織并聯(lián)合組織移植進行心肌修復(fù)與再生,逐漸成為干細胞心肌再生領(lǐng)域研究的重要發(fā)展趨勢。
E
2、SC和iPSC可在體內(nèi)外(在體內(nèi)體外均可以)分化為功能性的心肌細胞,但它們自發(fā)誘導(dǎo)分化為心肌細胞的效率很低,這種低下的誘導(dǎo)效率難以滿足細胞替代治療以及體外構(gòu)建組織工程心肌的需求。近年來,盡管ESC的心肌分化取得了令人振奮的研究成果,但長期分化中關(guān)于這種ESC源性心肌細胞的成熟和功能維持仍然缺乏進一步的研究。從干細胞到新生的中胚層再到心臟的原始細胞最終到終末分化的心肌細胞,涉及一系列細胞生長、生物發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控過程。細胞-細胞(cell-
3、cell)、細胞-基質(zhì)(cell-matrix)的相互作用可能是細胞高效誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵。共培養(yǎng)細胞通過細胞-細胞的相互作用可以形成有利于干細胞定向分化的微環(huán)境?;谶@一推測,本課題擬通過聯(lián)合維生素C(Vc)誘導(dǎo)和細胞共培養(yǎng)建立ESC的心肌分化模型。利用建立的ESC心肌分化模型觀察其對iPSC心肌分化的影響,探索共培養(yǎng)促進iPSC心肌分化的機制和高效誘導(dǎo)分化的方法;基于組織工程技術(shù)探討有效的心臟組織脫細胞的方法和iPSC在組織工程心肌構(gòu)建
4、中的應(yīng)用價值。
1)共培養(yǎng)心肌分化模型的建立
目的:觀察Vc誘導(dǎo)下小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)或新生心肌細胞(NCM)共培養(yǎng)對ESC心肌分化的影響,建立共培養(yǎng)心肌分化的模型。
方法:小鼠ESC通過懸滴培養(yǎng)形成EB,培養(yǎng)液添加0.1mmol/L的Vc來誘導(dǎo)其往心肌細胞分化。從實驗動物提取MEF和NCM作為共培養(yǎng)細胞,利用插入式培養(yǎng)皿建立EB與共培養(yǎng)細胞的非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)。觀察培養(yǎng)過程中EB的形態(tài)學(xué)變化,檢測心
5、臟特異基因的表達,評估不同培養(yǎng)環(huán)境的心肌分化率差異。
結(jié)果:在ESC分化第8d鏡下可觀察到跳動的EB。跳動的EB可表達心肌細胞特異性標(biāo)記物GATA4、MLC-2V、CX43,且cTnI、CX43細胞免疫熒光染色陽性。在ESC的分化過程中MEF或NCM共培養(yǎng)可以增加ESC分化中后期的跳動的EB所占百分比,促進心肌細胞的形成,其中NCM共培養(yǎng)的作用更為顯著。共培養(yǎng)促進GATA4、MLC-2V、CX43表達上調(diào),GATA6表達下調(diào)。
6、cTnI和CX43的免疫熒光檢測提示共培養(yǎng)環(huán)境下心肌細胞分化的成熟度有所提高,同樣以NCM共培養(yǎng)的作用更為顯著。
結(jié)論:MEF或NCM與EB共培養(yǎng)促進了ESC的心肌分化并有助于長期分化狀態(tài)的維持,與MEF共培養(yǎng)相比,NCM共培養(yǎng)的作用更為明顯。
2)共培養(yǎng)誘導(dǎo)iPSC向心肌細胞分化及其機制
目的:觀察共培養(yǎng)心肌細胞分化模型對iPSC心肌細胞分化的影響,建立iPSC心肌細胞分化的高效分化模型,并探索其分化機制
7、。
方法:小鼠iPSC通過懸滴培養(yǎng)形成EB,培養(yǎng)液添加0.1mmol/L的Vc以誘導(dǎo)其往心肌細胞分化。EB轉(zhuǎn)入非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)與MEF或NCM共培養(yǎng),觀察培養(yǎng)過程中EB的形態(tài)學(xué)變化,半定量PCR檢測Oct-4、GATA4、Nkx2.5、ANF、CX43的表達,定量PCR追蹤GATA4、ANF在分化4d、8d、12d、16d、20d、24d、28d、32d的表達。行β-腎上腺素能受體刺激觀察分化細胞的功能狀況,F(xiàn)CM和BrdU分
8、析檢測共培養(yǎng)條件下iPSC分化中期及后期的iPSCM增殖情況。行半定量PCR檢測integrinα1、integrinα2受體的表達。在細胞培養(yǎng)過程中,添加integrinα1受體阻斷劑,觀察其對心臟特異因子(aMHC)及心臟轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、Mef2C、GATA4)表達的影響。
結(jié)果:與ESC相同,在iPSC分化的第8d,顯微鏡下可觀察到EB出現(xiàn)跳動的區(qū)域。Oct-4是未分化iPSC的標(biāo)記物,在分化過程,Oct-4的表
9、達逐漸下降直至消失。EB可表達心肌特異性標(biāo)記物GATA4、Nkx2.5、ANF、CX43,MEF及NCM共培條件促進GATA4、Nkx2.5、ANF、CX43的表達上調(diào)。進一步采用定量PCR方法追蹤GATA4和ANF的表達,發(fā)現(xiàn)NCM共培養(yǎng)能夠更好地維持其表達。行β-腎上腺素能受體刺激實驗提示,相對于MEF共培養(yǎng),NCM共培養(yǎng)更能保持分化后期細胞的生理活性。FCM和BrdU分析提示MEF和NCM共培養(yǎng)可以促進分化后期的細胞增殖。α1β1
10、integrin抑制劑可影響iPSCM后期的基因表達,導(dǎo)致心臟特異因子(aMHC)及心臟轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、Mef2C、GATA4)表達下降。
結(jié)論:MEF或NCM共培養(yǎng)促進iPSC心肌分化作用主要體現(xiàn)在分化的后期,其機制與共培養(yǎng)維持了integrin受體信號通路的激活從而促進iPSC分化的心肌細胞增殖有關(guān)。
3)脫細胞基質(zhì)制備及組織工程心肌初步構(gòu)建
目的:基于組織工程技術(shù)探討有效的心臟脫細胞的方法和在
11、組織工程心肌構(gòu)建中的價值。
方法:摘取成年兔子的心臟,PBS沖洗干凈,通過SDS洗滌及酶消法去除組織內(nèi)細胞,獲得脫細胞基質(zhì),HE染色評價脫細胞情況,材料凍干后輻照消毒備用。利用共培養(yǎng)分化模型由ESC/iPSC制備大批量心肌細胞群,以差速貼壁法獲得相對純度的心肌細胞;以其為種子細胞,約106~7/ml的密度種植和注射到支架材料,DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1周、2周檢測材料支架種植心肌細胞后的變化,并與種植
12、前比較。免疫組化檢測輔肌動蛋白(α-actinin)的表達。
結(jié)果:SDS洗滌和酶消法可以去除組織表面的細胞,然而行HE染色卻發(fā)現(xiàn),SDS洗滌法消化后細胞基質(zhì)稍有破壞,組織內(nèi)仍殘留有細胞核成分;而酶消法基本將細胞外基質(zhì)保存完整,細胞成分已經(jīng)去除干凈。將ESC/iPSC分化的心肌細胞作為種子細胞,以106~107/ml的細胞密度種植和注射到基質(zhì)材料。在細胞種植一周,基質(zhì)材料表面已經(jīng)覆蓋有團狀的細胞,內(nèi)部的一些區(qū)域已經(jīng)有細胞長入;
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