2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是由于上、下運動神經(jīng)元變性導(dǎo)致延髓、四肢、軀干、胸部及腹部肌肉逐漸無力和萎縮,多因呼吸肌功能衰竭而死亡。其年發(fā)病率約為5/10萬-7/10萬,成年起病,患者多在首次出現(xiàn)癥狀后的3-5年內(nèi)死于呼吸衰竭,并且近年有上升的趨勢。目前尚無有效治療方法,目前唯一被美國FDA批準的臨床藥物是利魯唑(riluzole),但仍無法完全阻止疾病的進展,僅可使ALS患者的生存期平均延長3個月以上。其他的治療措施還包括維生素、神經(jīng)營

2、養(yǎng)因子及基因治療等,但都沒有確切效果。肌萎縮側(cè)索硬化癥的病因及發(fā)病機制尚不明確??赡芟嚓P(guān)的因素有:突變SOD1蛋白的毒性、與星形膠質(zhì)細胞的相互作用、TDP-43蛋白、炎癥、線粒體功能異常、谷氨酸鹽興奮毒性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。目前用于ALS研究的動物模型有多種,常用的動物模型是SOD1突變小鼠模型,其中表達人突變SOD1-G93A(第93位甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala))的小鼠模型是迄今為止最經(jīng)典、最接近人ALS的動物模型。其運動行為

3、及病理變化與人類ALS極為相似,且癥狀出現(xiàn)前已有肌電圖改變和線粒體損傷,便于ALS的早期研究。2006年8月,日本學(xué)者Shinya Yamanaka首次通過導(dǎo)入4種基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,將分化成熟的小鼠正常體細胞,重新誘導(dǎo)成為一個多功能的干細胞,具有類似胚胎干細胞的所有特性,將其命名為誘導(dǎo)性多能干細胞(iPS)。07年11月,日本和美國研究人員分別利用人體皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)出人類的iPS細胞。iPS細胞在形態(tài)學(xué)、

4、基因表達狀況和表觀遺傳修飾方面都與ES細胞十分相似。這些研究明確地證實了已分化的細胞可以通過少數(shù)幾個基因的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)。iPS細胞的應(yīng)用價值在于獲得方法相對簡單和穩(wěn)定,在技術(shù)上和倫理上都比其他方法更有優(yōu)勢。iPS細胞具有與胚體干細胞相似的形態(tài)學(xué)特點及生物學(xué)特性,目前對于iPS細胞的神經(jīng)分化方案,與胚體干細胞的神經(jīng)分化方法類似。已經(jīng)有研究報道將鼠的iPS細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等;將人的iPS細胞分化

5、為運動神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞等。但是,SOD1G93A基因突變是否會影響iPS細胞的誘導(dǎo)建立,以及是否會影響iPS細胞的神經(jīng)分化尚不明確。有鑒于此,本實驗的主要研究思路是,首先通過原代細胞培養(yǎng)法得到鼠尾成纖維細胞,轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)iPS細胞的產(chǎn)生;然后對iPS細胞進行多能性鑒定后確認具有胚胎干細胞特性;最后選取神經(jīng)元組織特異啟動子的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)iPS細胞,對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞進行神經(jīng)誘導(dǎo)分化,對所得到的熒光細胞進行鑒定和分析。本研究主要分為兩個

6、部分:
   第一部分SOD1G93A小鼠誘導(dǎo)性多能干細胞的建立及鑒定。
   目的:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒,通過病毒包裝技術(shù)產(chǎn)生相應(yīng)病毒,轉(zhuǎn)染SOD1G93A小鼠成纖維細胞。目的在于獲得iPS細胞并進行多能性鑒定。
   方法:⑴通過組織塊貼壁法培養(yǎng)SOD1G93A小鼠的鼠尾成纖維細胞。⑵將四種表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PLAT-E細胞,收集病毒,轉(zhuǎn)染成纖維細胞。⑶iPS細胞生物學(xué)特性的分析:對iPS細胞的分子標記及體內(nèi)

7、、外分化能力進行檢測。
   結(jié)果:①剪鼠尾組織,培養(yǎng)得到生長旺盛的鼠尾成纖維細胞。②包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒并轉(zhuǎn)染成纖維細胞得到胚胎干細胞克隆樣的iPS細胞。③iPS細胞生物學(xué)特性:iPS細胞表達AKP、Oct4、SSEA-1,在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細胞類型。iPS細胞具有胚胎干細胞特性。
   結(jié)論:⑴誘導(dǎo)建立了SOD1G93A小鼠的iPS細胞。⑵小鼠iPS細胞具有與ES細胞相似的生物學(xué)特性。
   第二部分:Tα

8、1α-tubulin/hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染iPS細胞及神經(jīng)分化研究。
   目的:將神經(jīng)元組織特異性啟動子2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠ES細胞和iPS細胞,抗性藥物篩選后進行神經(jīng)誘導(dǎo)分化,目的在于獲得穩(wěn)定攜帶該啟動子的小鼠ES細胞和iPS細胞克隆,并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞。
   方法:⑴將2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP的表達載體與ViraPower

9、TM LentiviralPackaging Mix共轉(zhuǎn)染239FT細胞48h至72h后,收集病毒上清液高速離心后,得到濃縮的病毒顆粒。⑵通過分次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將慢病毒轉(zhuǎn)入小鼠E14、iPS細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3天開始使用1-5μg/ml嘌呤霉素篩選7天以獲得帶有表達質(zhì)粒的純化的E14、iPS細胞。⑶加入誘導(dǎo)試劑促進E14、iPS細胞向神經(jīng)細胞分化,獲得表達Tα1-α-tubulin的綠色熒光細胞,并進行免疫組化和功能染色等的相關(guān)鑒定分析。

10、>   結(jié)果:①慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)3天后,加入1-5μg/ml的嘌呤霉素開始篩選,觀察到有一定量的細胞死亡。篩選一周后,得到抗嘌呤霉素的攜帶外源質(zhì)粒的純化的E14、iPS細胞。②加入各種誘導(dǎo)試劑促進iPS細胞向神經(jīng)元分化,獲得了表達Tα1-α-tubulin的綠色熒光細胞,進行流式細胞分析并分選后,經(jīng)免疫染色證實為神經(jīng)元。
   結(jié)論:⑴利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠iPS細胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)后的iPS細胞經(jīng)過篩選獲得純化的細胞群,細胞生長和分化能力不受病

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