iPS細胞分化的心臟前體細胞移植改善心梗小鼠心臟功能及機制研究.pdf

1、第一部分、無滋養(yǎng)細胞輔助的人脂肪干細胞重編程生成誘導多功能干細胞(iPS)
　　 目的：以人脂肪干細胞作為起始細胞，在無滋養(yǎng)細胞輔助條件下體外重編程生成誘導多能干細胞。
　　 方法：從人脂肪組織中分離脂肪干細胞，通過慢病毒載體以四種轉錄因子轉染人脂肪干細胞；無滋養(yǎng)細胞輔助條件下將其體外重編程為誘導多能干細胞，并以滋養(yǎng)細胞輔助的傳統(tǒng)重編程方法作為對照組，比較兩種方法重編程的效率；倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，分別取生長狀態(tài)良

2、好的2-3代細胞傳入24孔培養(yǎng)板，XTT法檢測細胞活性，并計數(shù)在不同時間點兩組細胞的數(shù)量以比較其增殖能力；重編程獲得的誘導多能干細胞行堿性磷酸酶和免疫熒光染色進行細胞表型鑒定；體內分化實驗鑒定細胞多能型；對誘導多能干細胞基因組學進行基因芯片（Microarray)分析。
　　 結果：
　　 1.將4種轉錄因子通過慢病毒載體轉染人脂肪干細胞后，在無滋養(yǎng)細胞輔助條件下可將其重編程為誘導多能干細胞。與傳統(tǒng)方法相比，使用人脂肪干

3、細胞作為起始細胞，在無滋養(yǎng)細胞輔助條件下的重編程效率明顯提高，且兩種方法所獲得的目的細胞的活性和增殖能力無統(tǒng)計學差異；
　　 2.細胞表型鑒定結果顯示，目的細胞可表達多種胚胎干細胞樣細胞因子；
　　 3.體內分化實驗表明，目的細胞可分化為全部三個胚層的細胞，具有多向分化潛能；
　　 4.Microarray基因芯片結果顯示，人脂肪干細胞重編程生成的誘導多能干細胞具有與人胚胎干細胞非常相似的基因表達圖譜。
　

4、　 結論：人脂肪干細胞不需滋養(yǎng)細胞輔助，即可在較短時間內體外重編程為誘導多能干細胞，并可代替成纖維細胞作為新的重編程起始細胞。
　　 第二部分、脂肪干細胞重編程誘導多能干細胞體外定向分化與報告基因轉染
　　 目的：將兩種報告基因轉染脂肪干細胞重編程的誘導干細胞，觀察其對誘導多能干細胞的影響；并研究誘導多能干細胞的體外定向分化能力。
　　 方法：用慢病毒載體將兩種報告基因分別或共轉染誘導多能干細胞，含不同報告基因

5、的誘導多能干細胞分為A168H組，GFP-Fluc組和A168H-GFP-Fluc組，未轉染組設為陰性對照，倒置相差顯微鏡觀察轉染后各組細胞形態(tài)，XTT法檢測細胞活性，計數(shù)不同時間點各組細胞的數(shù)目并比較其增殖能力；體外誘導各組細胞分化，行免疫熒光染色鑒定分化細胞表型；定向誘導各組細胞向心肌細胞分化，心肌細胞標志物免疫熒光染色鑒定心肌細胞表型；體外生物發(fā)光成像技術檢測HSVl-A168Htk+/GFP-Fluc+細胞數(shù)量與信號強度關系。<

6、br>　　 結果：
　　 1.轉染不同報告基因的各組細胞形態(tài)學與對照組無差異，細胞活性和增殖能力與對照組相似；
　　 2.體外多向分化實驗結果顯示，各組細胞多向分化潛能無統(tǒng)計學差異；免疫熒光結果顯示，分化細胞可表達內胚層細胞標記物AFP、Sox17，中胚層細胞標記物α-SMA或外胚層神經細胞標記物Tuj-1;
　　 3.心肌細胞定向誘導分化結果顯示，多能干細胞可在特定條件下分化為跳動的心肌細胞；免疫熒光結果示，

7、分化細胞的心肌細胞標記物α-actinin，c-TnT，nkx，mef2c均為陽性表達，進一步證實多能干細胞經體外誘導可分化為心肌細胞；
　　 4.體外生物發(fā)光成像結果說明轉染報告基因HSVl-A168Htk+/GFP-Fluc+的細胞，其成像信號與細胞數(shù)量成正相關。
　　 結論：誘導多能干細胞可體外分化為全部三個胚層的細胞類型，而慢病毒載體介導的報告基因轉染對細胞無不良影響，成像信號與細胞數(shù)量呈正相關，可用來在體追蹤細

8、胞生存情況。
　　 第三部分、誘導多能干細胞分化的心血管前體細胞移植改善心梗小鼠心臟功能及機制研究
　　 目的：觀察誘導多能干細胞分化的心血管前體細胞對心梗小鼠心臟功能的改善作用，并探討其作用機制。
　　 方法：體外誘導多能干細胞定向分化為心血管前體細胞，γ計數(shù)器和PET檢測報告探針體外吸收情況；建立免疫缺陷小鼠心梗模型，并隨機分為hASCs-iPS-CPC高劑量注射組（n=20只），hASCs-iPS-CPC低

9、劑量注射組（n=20只），PBS注射組(n=20只)，缺氧實驗組(n=10)和缺氧對照組(n=10)。各組于注射細胞后不同時間點行PET、生物發(fā)光成像在體檢測移植細胞數(shù)量；術后第1、14、28天行超聲心動圖、MRI掃描、PV loop以檢測各組小鼠心臟功能。術后28天斷頸處死各組小鼠，心臟標本行H&E染色，免疫熒光和TUNEL染色。缺氧實驗組每只小鼠左心室壁注射1X106個HSVl-A168Htk+/GFP-Fluc+CPC細胞，缺氧對

10、照組每只小鼠注射lx106個成纖維細胞，各組小鼠于術后3天處死，心臟標本冰凍切片，激光顯微切割獲取移植細胞行細胞因子定量分析。
　　 結果：
　　 1.Y計數(shù)器計數(shù)結果和PET成像結果顯示，轉染HSVI-A168Htk報告基因的hASCs-iPS-CPC細胞對PET探針18F_FHBG的吸收隨著孵育時間的延長而上升，120分鐘左右達到最高值。
　　 2.術后不同時間點對各組實驗動物分別行PET掃描，結果顯示移植細

11、胞后的小鼠于術后第1天即可觀察到很強的心臟PET信號，隨著時間的推移，PET信號逐漸減弱，而PBS對照組小鼠則未發(fā)現(xiàn)PET信號。BLI成像也顯示了與PET相同的結果。
　　 3.心功能檢測顯示，各組小鼠術后第1天心功能均較前明顯下降，高劑量組術后第14天LVFS(P=0.0143)及LVEF（P=0.0354），術后28天LVFS（P=0.0284）及LVEF(P=O.0356)與低劑量組和PBS組相比均明顯升高，且差異有統(tǒng)計學

12、意義。術后28天PV loop檢測結果示高劑量組ESV（P=0.0041）、EDV(P=0.0093)、ESP(P=O.O016)較低劑量組和PBS組顯著升高。
　　 4.不同時間點的LVFS與第一天PET信號結果聯(lián)合分析顯示，術后28天心功能與PET信號之間存在較明顯的相關性（R2=0.72）。
　　 5.各組小鼠心臟標本H&E染色結果示，高劑量組左心室壁厚度較低劑量組和PBS組明顯增加。免疫熒光染色結果示，高劑量組左