P38信號通路在氧化性低密度脂蛋白導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能改變方面的作用.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型特征的前體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。干細(xì)胞因子（SCF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF），HMG-coA還原酶抑制劑、粒系巨噬系集落刺激因子（GM-CSF）等都能自骨髓動員EPC，并促進(jìn)其增殖、分化、粘附和遷移能力.氧化性低密度脂蛋白是冠心病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其生物學(xué)作用主要是影響內(nèi)

2、皮細(xì)胞功能，并進(jìn)一步導(dǎo)致動脈粥樣硬化。研究證明EPC對維持內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要作用，并且參與了機(jī)體多種生理、病理性血管重建過程，在新形成的血管中，EPC來源的內(nèi)皮細(xì)胞約占總內(nèi)皮細(xì)胞的25％。EPC促進(jìn)血管生成和內(nèi)皮再生是因?yàn)镋PC能夠從骨髓動員到外周循環(huán)中，并歸巢到血管損傷和生成的部位。EPC歸巢需要多步驟協(xié)調(diào)作用，包括趨化、粘附、跨內(nèi)皮遷移及最終分化為內(nèi)皮細(xì)胞。最近，臨床試驗(yàn)表明冠狀動脈疾病患者培養(yǎng)的EPC數(shù)量及遷移能力明顯

3、下降。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）為心血管疾病的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而且冠狀動脈疾病及糖尿病患者血漿oxLDL生成明顯增加。以前的研究表明oxLDL能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、增加內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)、抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移而抑制血管新生?；谝陨涎芯勘尘?，我們推測。oxLDL可能為影響EPC數(shù)量和功能的因素。本研究的目的是觀察oxLDL是否影響外周血EPC的數(shù)量；是否改變了EPC的增殖功能、遷移功能及粘附能力；oxLDL對EPC的體外血管生成

4、能力的影響程度；同時(shí)觀察oxLDL是否影響EPC的P38信號表達(dá)，來影響EPC的數(shù)量、功能。本研究分為二個(gè)部分，主要研究方法和結(jié)果如下： 第一章氧化型低密度脂蛋白對內(nèi)皮祖細(xì)胞存活和功能的影響 目的：研究氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）對EPC存活及功能的影響方法： 1.EPC的分離、培養(yǎng)：取健康成人空腹外周靜脈血，用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)7天，收集貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞隨機(jī)分成5組：①對照組；②oxLDL

5、各濃度組（共3組）：在培養(yǎng)液中分別加入25，50，100，200μg/ml后培養(yǎng)24小時(shí)；③LDL組：含100μg/ml的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。 2.細(xì)胞染色與鑒定：分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。 4.EPC粘附能力檢測：收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μl培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，然后將等量EPC接種到包被有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)30min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。 5.EPC遷移能力檢測：收集貼壁細(xì)胞

6、并計(jì)數(shù)。將600μl培養(yǎng)液和VEGF（50ng/mL）加入改良的Boyden室的下室，將2×104EPC懸浮在100μl培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動細(xì)胞，計(jì)數(shù)遷移到低層的細(xì)胞。 6.EPC增殖能力檢測：采用promega公司的Non-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒MTS/PMS比色法檢測細(xì)胞增殖率，按操作程序執(zhí)行。 結(jié)果： 1.EPC的鑒定：分離

7、獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)3天即可看到貼壁生長，7天后形成梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-Ⅰ對細(xì)胞染色后，通過熒光顯微鏡鑒定UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPC占貼壁細(xì)胞的90％。流式細(xì)胞儀檢測貼壁細(xì)胞表面標(biāo)志。 2.oxLDL對外周血EPC數(shù)量的影響：不同濃度的OxLDL干預(yù)EPC后24小時(shí)，結(jié)果顯示：oxLDL顯著減少EPC數(shù)量，并且EPC數(shù)量隨著oxLDL的濃度的增加而減少。而L

8、DL對EPC數(shù)量無影響。 4.OxLDL對外周血EPC遷移功能的影響：OxLDL各濃度組明顯減少EPC的遷移能力，而LDL對EPC的遷移無影響。 5.OxLDL對外周血EPC增殖功能的影響：EPC的增殖能力在OxLDL各濃度組抑制了EPC的增殖，并且隨著其濃度的增加而加劇。 結(jié)論： 1.OxLDL在體外能減少EPC數(shù)量，作用呈濃度依賴性； 2.OxLDL在體外能抑制EPC的增殖、遷移、粘附能力，作

9、用呈濃度和依賴性； 3.OxLDL能降低EPC的體外血管生成能力；提示OxLDL是導(dǎo)致EPC數(shù)量及功能減弱的因素之一。 第二章P38信號通路參與oxLDL對內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響 目的：研究oxLDL是否導(dǎo)致EPC細(xì)胞內(nèi)P38及P-P38的表達(dá)異常，以及oxLDL對EPC的作用是否與細(xì)胞內(nèi)P38的信號有關(guān)。 方法： 1.EPC分離，培養(yǎng)，及分組：EPC的分離及培養(yǎng)見第一章，收集貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)

10、胞隨機(jī)三組：①對照組；②oxLDL組：在培養(yǎng)液中加入100μg/ml的oxLDL③SB203580組：在培養(yǎng)液中加入100μg/ml的oxLDL前，預(yù)先半小時(shí)加入0.5μM的SB203580。 2.Western檢測p38及p-p38的表達(dá)：oxLDL（100μg/ml）處理EPC后0，5，15，25，35分鐘及SB203580預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)p38，及p-p38蛋白的表達(dá)；以及oxLDL25，50，100，200μg/ml以及L

11、DL100μg/ml處理30分鐘后細(xì)胞內(nèi)p38，及p-p38蛋白的表達(dá)。 3.EPC凋亡分析： 按BDBiosciences公司的說明進(jìn)行操作：各組EPC處理結(jié)束后，用0.1％胰酶消化，40℃PBS洗兩次后，重懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。取100μl細(xì)胞懸液至5ml試管中，加5μlAnnexinⅤ-FITC標(biāo)記液和5μlPI，輕輕混勻。并設(shè)立無AnnexinⅤ及PI的空白對照、僅AnnexinⅤ的對

12、照、僅PI的對照。室溫避光孵育15min后，加400μl結(jié)合緩沖液，1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測EPC雙染色鑒定EPC數(shù)量，EPC粘附能力檢測，遷移能力檢測，EPC增殖能力檢測，體外血管生成能力檢測實(shí)驗(yàn)方法見第一章。 結(jié)果： 1.western檢測結(jié)果：100μg/ml的oxLDL處理EPC后，細(xì)胞內(nèi)p-p38成時(shí)間依賴性表達(dá)增強(qiáng)，大約25min時(shí)達(dá)頂峰，5，15，25，25，35分鐘細(xì)胞內(nèi)p-p38的表達(dá)是對照組的1.4±

13、0.15倍，2.1±0.22倍，3.2±0.34倍，1.5±0.13倍，且p38拮抗劑sb203580可抑制其表達(dá)，是對照組的1.2±0.13倍，與各時(shí)間點(diǎn)比較有顯著性差異，P<0.05。不同濃度的OxLDL處理25min后觀察，細(xì)胞內(nèi)p-p38成劑量依賴性表達(dá)增強(qiáng)，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml處理EPC后，其細(xì)胞內(nèi)p-p38的表達(dá)是分別對照組的1.2±0.13，1.7±0.18，3.2±0.35，

14、3.4±0.35。而LDL對其沒影響。細(xì)胞內(nèi)p38表達(dá)不受時(shí)間和濃度的影響。 2.100μg/ml的oxLDL處理EPC后，導(dǎo)致EPC數(shù)量減少，增殖減低，凋亡增加，粘附及遷移能力減低，體外成血管能力減弱。而sb203580能減弱100μg/ml的oxLDL對EPC的作用。 結(jié)論： oxLDL對EPC的作用與細(xì)胞內(nèi)磷酸化的p38表達(dá)及活性有關(guān)。P38的抑制劑sb203580能抑制oxLDL對EPC的毒性作用。提示o