丁香活性組分抑制PI3K-Akt-mTOR通路誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞自噬與凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　檢測丁香活性組分(The active fraction from clove，AFC)對人結(jié)腸癌HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO細胞增殖的抑制作用，篩選出抑制作用最明顯的HCT116細胞株;探討丁香活性組分誘導(dǎo)HCT116細胞產(chǎn)生自噬與凋亡，并通過聯(lián)合自噬特異性抑制劑巴弗洛霉素A1(Baflomycin A1)、3-甲基腺嘌呤（3-MA）闡明其誘導(dǎo)的凋亡與自噬之間的相互關(guān)系;研究丁香活性組分對人

2、結(jié)腸癌細胞PI3K/Akt/m-TOR信號通路的影響，揭示丁香活性組分誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞自噬與凋亡的分子機制。
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)：HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO細胞株復(fù)蘇后，分別用McCoy's5A、RPMI1640、RPMI1640、DMEM高糖、F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％青霉素鏈霉素液，于37℃、5％CO2條件下孵箱中培養(yǎng)。
　　2、細胞活力檢測：①AFC(25、50、10

3、0、200、400μg/ml)處理各腫瘤細胞48h，CCK8法檢測各腫瘤細胞的細胞增殖能力變化。②AFC(25、50、100μg/ml)處理HCT116細胞24、48、72h，CCK8法檢測AFC對HCT116細胞細胞增殖能力的時間濃度依賴性影響。
　　3、細胞凋亡檢測：AFC(25、50、100μg/ml)作用于HCT116細胞48h后，采用Hoechst33258熒光染色、流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測A

4、FC對HCT116細胞凋亡的影響;采用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋Caspase-3、Caspase-9、PARP的表達。
　　4、細胞自噬檢測：①GFP-LC3轉(zhuǎn)染：Ad-mCherry-GFP-LC3B重組腺病毒轉(zhuǎn)染HCT116細胞24h，加入AFC100μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)48h，4％多聚甲醛固定，熒光顯微鏡下拍照并計數(shù)自噬斑點的數(shù)目來檢測自噬水平的強弱。②透射電子顯微鏡觀察：胰酶收集細胞，以2.5％的戊二醛溶液、1

5、％四氧化鋨溶液固定后，采用梯度乙醇溶液脫水，環(huán)氧樹脂812包埋細胞，制成超薄切片。醋酸雙氧鈾和醋酸鉛染色后在透射電鏡觀察自噬體和自噬溶酶體的形成。
　　結(jié)果：
　　1、CCK8結(jié)果顯示，AFC對HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的半數(shù)抑制濃度分別是113.5±7.83μg/ml、174.9±9.52μg/ml、211.7±7.29μg/ml、232.3±15.42μg/ml、280.9±12.61tg/m

6、l，抑制作用最明顯的是人結(jié)腸癌細胞HCT116。AFC（25-100μg/ml）作用HCT116細胞24h，CCK8結(jié)果顯示并未對細胞產(chǎn)生很明顯的抑制效果;作用HCT116細胞48h，25、50、100μg/ml AFC分別能抑制細胞活力至84.06％±9.15％、80.05％±6.05％、68.20％±4.12％;作用HCT116細胞72h，25、50、100μg/ml AFC分別能抑制細胞活力至81.03％±7.2％、74.33％±

7、7.51％、61.43％±4.32％;50、100μg/ml AFC組在48、72h與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　2、Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下觀察到對照組細胞成彌散均勻的淡藍色弱熒光，細胞形態(tài)趨于一致。25、50、100μg/ml AFC處理細胞后，均能觀察到典型的細胞凋亡特征，如核染色質(zhì)濃縮、核碎裂、凋亡小體的出現(xiàn)等，且各組凋亡形態(tài)學(xué)改變的程度與AFC作用的濃度呈正相關(guān)。Anne

8、xinⅤ-FITC/PI雙染法檢測顯示，25、50、100μg/ml的AFC誘導(dǎo)HCT116細胞率分別為8.35％±0.61％、17.68％±1.19％、26.95％±1.75％，50、100μg/ml組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（P值均＜0.001）;Western blot結(jié)果顯示，Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP均被AFC以濃度依賴方式激活。50、100μg/ml AFC組Cl

9、eaved Caspase-3/Procaspase-3、Cleaved PARP/PARP、Caspase-9/Actin與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　3、①GFP-LC3轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察到結(jié)果：對照組細胞mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光形式存在于細胞質(zhì)中，100μg/ml AFC組細胞出現(xiàn)明顯自噬斑點，mCherry-GFP-LC3B聚集在自噬體膜上，以黃色斑點和紅色斑點的形式

10、表現(xiàn)出來。②100μg/ml AFC作用于HCT116細胞48h后，透射電鏡觀察到大量的自噬體和自噬溶酶體，而對照組則無明顯變化。③Western blot結(jié)果顯示，AFC(25、50、100μg/ml)作用12、24、48h后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1相對表達量均呈濃度依賴性的逐漸增高。50μg/ml、100μg/mlAFC組在12、24、48h時，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.0

11、5）;Beclin-1/Actin與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　4、CCK8法結(jié)果顯示，作用于HCT116細胞48h后，BA組、3-MA組、AFC組、AFC+3-MA組、AFC+BA組分別抑制細胞增值率為91.5％±7.09％、89.7％±9.01％、74.3％±5.13％、40.5％±2.51％、54.2％±4.04％。BA組、3-MA組與對照組比較，無顯著差異;AFC組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

12、P＜0.001);AFC+3-MA組、AFC+BA組與AFC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.001）。AnnexinⅤ/PI雙染法檢測顯示，Control組、BA組、3-MA組、AFC組、AFC+3-MA組、AFC+BA組凋亡率分別為6.36％±0.31％、6.65％±0.40％、7.21％±0.69％、27.64％±1.74％、45.02％±1.85％、40.8％±1.79％。BA組、3-MA組與對照組比較，無顯著差異;AFC組

13、與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（P＜0.001）;AFC+3-MA組、AFC+BA組與AFC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在3-MA組、AFC+3-MA組中相對表達量明顯減少，在AFC組、BA組、AFC+BA組中相對表達量明顯增加;自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在AFC組中相對表達量明顯增加，在BA組、3-MA組、AFC+3-MA、A

14、FC+BA組中相對表達量明顯下降。Western Blot結(jié)果顯示，與Control組比較，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP在AFC組、AFC+3-MA、AFC+BA組中相對表達量顯著上升，而在BA組、3-MA組中無明顯變化。分析顯示Cleaved Caspase-3/Procaspase-3、Cleaved PARP/PARP，BA組、3-MA組與Control組比較，無顯著差異;AFC組與Co

15、ntrol組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（P＜0.01）;AFC+3-MA組、AFC+BA組與AFC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.001）。
　　5、Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量呈濃度依賴性的遞減，而PI3K、Akt、m-TOR在各組間無明顯變化。50、100μg/ml AFC組p-Akt/Akt、p-mTOR/m-TOR表達量與Control組

16、比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，LY294002(10μM)、AFC(100μg/ml)、AFC+LY294002作用HCT116細胞48h后，與Control組比較，p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量呈依次降低，而Akt、m-TOR在各組間無明顯變化。AFC組與Control組比較，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.001）;AFC+LY2940

17、02組與AFC組比較，p-Akt/Akt差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，p-mTOR/mTOR差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、AFC對人結(jié)腸癌細胞HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的增殖均有一定抑制作用，但作用明顯的是HCT116細胞，呈現(xiàn)一定的時間、濃度依賴性。
　　2、AFC濃度相關(guān)性的誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細胞發(fā)生凋亡，凋亡發(fā)生的途徑與線粒體依賴性的Caspase

18、激活有關(guān)。
　　3、AFC誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細胞發(fā)生自噬，誘導(dǎo)自噬的作用呈現(xiàn)時間、濃度依賴性。
　　4、AFC聯(lián)合自噬抑制劑BA、3-MA能減弱AFC誘導(dǎo)的HCT116細胞自噬，而增強其誘導(dǎo)的凋亡的發(fā)生，說明AFC誘導(dǎo)的HCT116細胞自噬對細胞起到保護性的作用，提高細胞對AFC的抵抗能力。
　　5、AFC單獨用藥或聯(lián)合LY294002用藥，均證實AFC能濃度相關(guān)性的抑制PI3K/Akt/m-TOR通路，這與AF