阻斷PI3K-AKT-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)胃癌細(xì)胞放化療耐受影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤。超過70％的新發(fā)病例和死亡病例出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家。胃癌治療的主要手段有手術(shù)、放療和化療。但是部分患者經(jīng)過放療、化療后仍然會(huì)出現(xiàn)局部進(jìn)展和放化療耐受的情況。因此，明確胃癌治療后局部進(jìn)展和放化療耐受的機(jī)制，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性，提高放化療的有效率是胃癌治療過程中亟待解決的問題。
　　本研究以胃癌細(xì)胞株BGC-823為研究對(duì)象，從以下兩個(gè)方面進(jìn)一步探討胃癌放化療治療后

2、腫瘤局部進(jìn)展以及放化療耐受的可能機(jī)制:1.胃癌細(xì)胞經(jīng)過化療藥物處理后的細(xì)胞干性、EMT、PI3K通路蛋白、耐藥相關(guān)酶以及對(duì)放療敏感性變化的研究；2.通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路提高放化療敏感性的機(jī)制研究。
　　第一部分胃癌細(xì)胞經(jīng)過化療藥物處理后的細(xì)胞干性、EMT、PI3K通路、化療敏感性的變化及放療耐受的可能機(jī)制
　　目的：
　　比較5-FU，L-OHP單獨(dú)或者聯(lián)合處理胃癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物、EMT

3、標(biāo)志物、細(xì)胞周期、藥物代謝酶以及信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化。分析細(xì)胞出現(xiàn)化療藥物和放射線耐受的原因和可能機(jī)制。
　　方法：
　　采用CCK-8法檢測(cè)氟尿嘧啶（Fluorouracil，5-FU）,奧沙利鉑（Oxaliplati， L-OHP）作用胃癌細(xì)胞的抑制率，計(jì)算IC50,比較細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異；采用Western blotting和RT-PCR檢測(cè)化療藥物處理細(xì)胞后CD44、Nanog、Oct4、Sox2、E-cadherin和

4、N-cadherin表達(dá)情況。Western blotting方法檢測(cè)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase，TS酶）、二氫嘧啶脫氫酶（Dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD酶）和ERCC1蛋白表達(dá)的影響。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；克隆形成實(shí)驗(yàn)比較藥物處理后細(xì)胞接受不同劑量放射線照射后克隆形成能力的差異。

5、免疫組化方法分析胃癌術(shù)后患者組織標(biāo)本中Nanog、Oct4、Sox2和E-cadherin蛋白表達(dá)情況。以及 Nanog、Oct4、Sox2和 E-cadherin表達(dá)水平同患者預(yù)后之間關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　未經(jīng)處理的胃癌細(xì)胞呈相互連接生長(zhǎng)，使用化療藥物處理細(xì)胞后，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞變圓，失去正常形態(tài)。Western blotting和RT-PCR均提示化療藥物治療腫瘤細(xì)胞后引起干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)升高，特別是5-FU+L

6、-OHP治療組升高更明顯。5-FU+L-OHP組的CD44、Nanog、Oct4和Sox2表達(dá)明顯高于單用5-FU或者L-OHP處理組。而5-FU+L-OHP組的E-cadherin表達(dá)和其他治療組以及未治療細(xì)胞相比表達(dá)明顯下調(diào)，相反 N-cadherin表達(dá)卻明顯上調(diào)。同時(shí)，化療藥物處理細(xì)胞后引起TS酶、DPD酶和ERCC1等蛋白升高，降低胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白分析提示，藥物處理后的細(xì)胞出現(xiàn)PI3K/AKT/m

7、TOR信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白p-AKT和p-mTOR、p85和p110表達(dá)的升高。特別是5-FU+L-OHP治療組通路蛋白升高更為明顯。對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)化療藥物處理后使S期細(xì)胞亞群比例由30±0.8%升高到80±1.7%?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)表明聯(lián)合處理組細(xì)胞對(duì)放射線具有耐受性。對(duì)人胃癌組織術(shù)后標(biāo)本的分析發(fā)現(xiàn), Nanog、 Oct4、 Sox2和 E-cadherin在標(biāo)本中的表達(dá)率分別為26.1%、53.6%、49.3%和

8、60.9%。Nanog、Sox2、Oct4和E-cadherin的表達(dá)同患者的性別、年齡和分化程度無關(guān)，但是Sox2表達(dá)差異同臨床分期有關(guān)。Oct4的表達(dá)水平同淋巴結(jié)侵犯有關(guān)。E-cadherin表達(dá)水平同淋巴結(jié)侵犯及臨床分期相關(guān)。Oct4的高表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)同患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　化療藥物處理細(xì)胞后出現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，E-cadhrein表達(dá)下調(diào)，同時(shí)藥物代謝酶升高，細(xì)胞周期阻滯在S期，

9、PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路激活，細(xì)胞對(duì)放化療出現(xiàn)耐受性。
　　第二部分PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路在胃癌放化療耐受中的作用
　　目的：
　　第一部分結(jié)果提示化療藥物處理細(xì)胞后引起細(xì)胞干性增強(qiáng)、EMT增強(qiáng)、耐藥相關(guān)酶表達(dá)升高、PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活、細(xì)胞周期S期阻滯和細(xì)胞對(duì)放化療耐受。采用 NVP-BEZ235阻滯該信號(hào)傳導(dǎo)通路，分析其對(duì)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞性，細(xì)胞周期，放化療耐受的影響。

10、
　　方法：
　　采用 CCK-8方法檢測(cè) NVP-BEZ235對(duì)聯(lián)合藥物處理后細(xì)胞增殖的影響。Western blotting分析 NVP-BEZ235處理細(xì)胞后干細(xì)胞標(biāo)志物以及 EMT標(biāo)志物CD44、Nanog、Oct4、Sox2、E-cadherin和 N-cadherin表達(dá)情況。比較阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后對(duì)該信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白p85、p110、p-AKT和p-mTOR，以及TS酶、DPD酶和ERCC1等

11、的影響。流式細(xì)胞技術(shù)分析NVP-BEZ235對(duì)細(xì)胞周期的影響?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)比較阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路后細(xì)胞對(duì)放療敏感性是否恢復(fù)。
　　結(jié)果：
　　NVP-BEZ235對(duì)聯(lián)合化療藥物處理后細(xì)胞具有殺傷作用。采用其阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路后，引起干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、Nanog、Oct4和Sox2表達(dá)下調(diào)。EMT標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin表達(dá)下調(diào)。同時(shí)通路蛋白p85、p110、p-AKT

12、和p-mTOR以及TS酶，DPD酶和ERCC1表達(dá)均下調(diào)。說明該通路阻滯后腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞性減弱，EMT現(xiàn)象下降，藥物耐藥酶的表達(dá)降低，細(xì)胞對(duì)化療敏感性部分恢復(fù)。細(xì)胞周期分析，使用NVP-BEZ235后 S期細(xì)胞亞群比例由80±1.7%下降到36.3±3.2%。克隆形式試驗(yàn)也說明阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后，細(xì)胞對(duì)放療的敏感性部分恢復(fù)。
　　結(jié)論：
　　通過阻斷細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路，能夠降低胃癌