新型靶向藥物FIM-A對骨肉瘤PI3K-Akt-mTOR通路的影響.pdf

1、目的:
　　1、體外培養(yǎng)大鼠骨肉瘤UMR-106細胞株,構(gòu)建裸鼠骨肉瘤原位移植瘤模型,為研究mTOR蛋白靶向藥物FIM-A(AP23573)對大鼠骨肉瘤的影響構(gòu)建實驗平臺。
　　2、檢測mTOR蛋白在大鼠成骨細胞和骨肉瘤細胞,以及骨組織和裸鼠骨肉瘤中的表達。
　　3、研究mTOR蛋白靶向藥物FIM-A(AP23573)對骨肉瘤UMR-106細胞增殖、周期、凋亡以及血管形成相關(guān)因子分泌的影響。
　　4、研究mTOR

2、蛋白靶向藥物FIM-A(AP23573)對大鼠骨肉瘤“原位移植”模型腫瘤體積、PCNA、微血管密度以及凋亡的影響。
　　5、研究mTOR蛋白靶向藥物FIM-A(AP23573)對于大鼠骨肉瘤PI3K/Akt/mTOR通路的影響并探討可能治療機制。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)大鼠骨肉瘤UMR-106細胞,原位注射法構(gòu)建裸鼠原位瘤模型。
　　2、采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法,從mRNA水平

3、檢測PI3K/Akt/mTOR通路蛋白在大鼠成骨細胞和骨肉瘤細胞、大鼠骨組織和裸鼠模型的原位腫瘤組織中的表達情況。
　　3、采用10-5,10-6,10-7,10-8,10-9M五個劑量的FIM-A(AP23573)作用于UMR-106單細胞,CCK-8試劑、流式細胞術(shù)、Elisa(酶聯(lián)免疫吸附法)分別觀察藥物對細胞增殖、周期凋亡、以及HIF1a(低氧誘導(dǎo)因子1)和VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)分泌的影響。
　　4、采用2.5

4、mg/kg、5mg/kg、10mg/kg三個劑量的FIM-A(AP23573)作用于裸鼠原位移植瘤模型,觀察藥物對荷瘤裸鼠的體重,以及腫瘤體積、生長抑制率、微血管密度(CD34)、增殖抗體PCNA變化、細胞凋亡因子CC3的影響,評價抗腫瘤活性。
　　5、察mTOR靶向藥物FIM-A(AP23573)對大鼠骨肉瘤UMR-106細胞以及骨肉瘤裸鼠原位移植瘤PI3K/Akt/mTOR通路上游mTOR,p-mTOR,以及下游4E-BP1、

5、p-4E-BP1、p70S6K,p-p70S6K的變化的影響,探討其治療骨肉瘤的可能機制。
　　結(jié)果:
　　1、建立了大鼠骨肉瘤裸鼠原位移植瘤模型。
　　2、正常SD大鼠成骨細胞以及骨組織的mTOR、4E-BP1、p70S6K表達均較大鼠骨肉瘤細胞以及裸鼠模型的原位腫瘤組織低。
　　3、FIM-A(AP23573)能顯著抑制大鼠骨肉瘤UMR-106細胞的生長,最大作用濃度在10-5和10-6M間;并使腫瘤細胞周期

6、停滯在G1期,明顯減少HIF1α和VEGF的分泌,但是對細胞沒有明顯的促進凋亡作用。
　　4、在體內(nèi)實驗中,FIM-A(AP23573)能夠顯著抑制腫瘤體積的增長,免疫組化顯示FIM-A(AP23573)能夠抑制移植瘤細胞增殖,減少血管密度,但沒有明顯的促凋亡作用。
　　5、通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),FIM-A(AP23573)能夠下調(diào)大鼠骨肉瘤UMR-106細胞以及骨肉瘤裸鼠原位移植瘤PI3K/Akt/mTOR

7、通路上游p-mTOR,以及下游p-4E-BP1,p-p70S6K的表達,從而達到治療骨肉瘤的目的。
　　結(jié)論:
　　1、應(yīng)用UMR-106細胞原位移植的方法能夠構(gòu)建穩(wěn)定的裸鼠骨肉瘤模型。
　　2、PI3K/Akt/mTOR通路蛋白在骨肉瘤中存在異常表達和活化,可成為mTOR靶向治療的靶點。
　　3、在體外實驗中,FIM-A(AP23573)能顯著抑制大鼠骨肉瘤UMR-106細胞的生長;在體內(nèi)實驗中,FIM-A(A