β-羥基異戊酰紫草素通過PI3K-AKT-mTOR信號通路靶向抑制宮頸癌的實驗研究.pdf

1、宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。臨床上，宮頸癌的治療方法主要有手術切除、放療、化療以及中醫(yī)中藥治療。最佳的治療方法則是結(jié)合各種療法的優(yōu)點，對宮頸癌實施多學科綜合治療。近年來研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B/mammaliantarget of rapamycin，PI3K/AKT/mTO

2、R)信號通路具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長、促進細胞周期進展、參與新生血管形成以及使腫瘤細胞產(chǎn)生放化療拮抗等多種功能，是最主要的抑制腫瘤細胞凋亡的信號通路。在惡性腫瘤的發(fā)生過程中存在PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，因此，阻斷該信號通路對惡性腫瘤的治療與預后均具有重要意義?；赑I3K/AKT/mTOR信號通路開發(fā)相關靶點抑制劑，通過觸發(fā)腫瘤細胞凋亡以及聯(lián)合應用化放療在宮頸癌多學科綜合治療中發(fā)揮重要作用，已成為宮頸癌分子靶向治療的重要熱點

3、。
　　中醫(yī)藥在宮頸癌多學科綜合治療中具有獨特作用。紫草素(shikonin)是一類從紫草植物根中提取的萘醌類化合物，化學成分復雜，具有抗腫瘤、抗炎、抗HIV病毒和抗真菌等廣泛的藥理作用。由于紫草素的毒性較強而其抗腫瘤作用不具特異性，因而未能在臨床上被推廣應用。近年來，提取或合成高效低毒的紫草素衍生物的研究備受關注。β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikon，β-HIVS)即是天然存在的紫草素衍生物之

4、一。β-HIVS通過抑制腫瘤細胞生長增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、干擾腫瘤細胞生長周期，使其具有開發(fā)為新型高效低毒抗腫瘤藥物的潛力。本課題通過體內(nèi)外實驗來研究β-HIVS抗宮頸癌的分子作用機制以及與PI3K/AKT/mTOR信號通路的相關性，為臨床宮頸癌的中藥分子靶向治療提供新的策略和有效途徑。
　　第一部分 PTEN、Survivin、PI3K/AKT/mTOR信號通路與宮頸癌變演化關系的臨床研究
　　目的:結(jié)合宮頸病變的臨床病

5、理學特征，探討PTEN、Survivin、PI3K、AKT、mTOR、P70S6K在宮頸癌變演化過程中的表達及其臨床意義。
　　方法:收集20例宮頸糜爛伴鱗狀上皮化生、60例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各20例)以及56例宮頸鱗狀上皮細胞癌組織標本。應用免疫組織化學（SP法）、實時定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測各組宮頸組織中PTEN、Survivin、PI3K、AKT、m

6、TOR、P70s6K的表達。選取10例正常宮頸組織作為對照組。
　　結(jié)果:1）在宮頸癌變演化過程中，從正常宮頸、宮頸糜爛伴鱗化、宮頸上皮內(nèi)瘤變到宮頸癌，PTEN陽性表達率逐漸減弱(P＜0.05);而Survivin的表達率則逐漸增高(P＜0.05);PI3K、AKT、mTOR、P70s6K在正常宮頸、宮頸糜爛伴鱗化、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸癌組織中的陽性表達率均呈逐漸增加趨勢(P＜0.05)。2) PTEN在宮頸癌中的陽性表達與臨床

7、分期、病灶大小有關(P＜0.05);Survivin在宮頸癌中的陽性表達與臨床分期、病灶大小和腫瘤分化程度有關(P＜0.05);宮頸癌組織中PI3K、AKT和mTOR的陽性表達率與臨床分期、分化程度有關（P＜0.05）;P70S6K在宮頸癌中的陽性表達與臨床分期有關(P＜0.05)。3）PTEN與Survivin在宮頸癌組織中的表達呈顯著負相關（r2=-0.613，P＜0.01）;P70s6K在宮頸癌組織中的表達與PI3K、AKT、mT

8、OR呈明顯正相關(r10=0.418，P＜0.01;r11=0.512，P＜0.05; r12=0.365，P＜0.01);PI3K與AKT、mTOR呈明顯正相關(r13=0.438，P＜0.01;r14=0.366，P＜0.01);AKT與mTOR呈明顯正相關(r15=0.351，P＜0.01)。4）qRT-PCR檢測顯示，PTEN mRNA在宮頸癌、CINⅢ組織中的表達顯著低于正常宮頸組織(P＜0.01);Survivin mRNA

9、在宮頸癌、CINⅢ組織中明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01);PI3K、AKT、mTOR和P70S6KmRNA在宮頸癌、CINⅢ組織中均明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01)，在CINⅡ組織中的表達也均高于正常宮頸組織(P＜0.05)。5)Western Blot檢測顯示，PTEN蛋白在宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ組織中的表達顯著低于正常宮頸組織(P＜0.01);Survivin蛋白表達在宮頸癌、CINⅢ組織中明顯高于正常宮頸組織

10、(P＜0.01)，在CINⅡ中的表達亦高于正常宮頸組織(P＜0.05);PI3K在宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ組織中的表達均明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01); AKT、mTOR和P70s6K蛋白表達在宮頸癌、CINⅢ組織中均明顯高于正常宮頸組織(P＜0.01)，在CINⅡ中的表達也均高于正常宮頸組織(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PTEN、Survivin、PDK、AKT、mTOR和P70S6K在宮頸癌變演化過程中存在聯(lián)

11、合表達，協(xié)同參與了宮頸癌的發(fā)生及其進展。聯(lián)合檢測為宮頸癌的早期診斷和預后判斷提供了新的評價指標，也為宮頸癌的基因治療提供了新的生物學靶點。
　　第二部分 β-羥基異戊酰紫草素通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導人宮頸癌Hala細胞凋亡的體外實驗研究
　　目的:研究β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對人宮頸癌Hela細胞的體外生長抑制作用，探討β-HIVS促腫瘤細胞凋亡的分子作用機制。
　　方法:以不同濃度β-H

12、IVS作用人宮頸癌Hela細胞，MTT法檢測β-HIVS對Hela細胞體外增殖的抑制率;AO/EB染色法熒光顯微鏡觀察Hela細胞凋亡的形態(tài)學變化;Annexin/PI雙標記法檢測Hela細胞凋亡率;流式細胞儀分析Hela細胞周期分布;qRT-PCR和Westernblot法檢測Hela細胞中PI3K、AKT、mTOR、P70s6K的mRNA和蛋白表達水平變化。
　　結(jié)果:1）β-HIVS對Hela細胞體外增殖有顯著的抑制作用，呈

13、現(xiàn)明顯的量效關系和時間依賴性。2）隨著β-HIVS濃度增加，Hela細胞凋亡的數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)均發(fā)生重要改變，細胞凋亡率也逐漸增加。細胞周期分析顯示，β-HIVS引起Hela細胞周期分布發(fā)生變化，表現(xiàn)為G0/G1細胞數(shù)下降，S期細胞數(shù)增多，而G2/M期細胞數(shù)則無明顯變化，細胞阻滯于S期。3）三種不同濃度β-HIVS作用Hela細胞，對PI3K、AKT、mTOR、P70S6K表達水平的影響呈時間和劑量依賴性;藥物作用48h后，β-HIVS能

14、顯著下調(diào)Hela細胞中PDK、AKT、mTOR和P70s6K的mRNA表達水平，并下調(diào)PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、P70s6K的蛋白表達水平。
　　結(jié)論:β-HIVS能顯著抑制Hela細胞增殖，呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴性。β-HIVS誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路以及降低該通路中相關下游基因蛋白表達水平而發(fā)揮其抗癌作用。針對該信號通路的中藥分子靶向治療有望成為宮頸癌治療的新途徑。<

15、br>　　第三部分 β-羥基異戊酰紫草素通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制宮頸癌裸鼠移植瘤生長的實驗研究
　　目的:建立宮頸癌荷瘤裸鼠動物模型，觀察β-HIVS的體內(nèi)抑瘤效果，探討其抗腫瘤作用的分子機制。
　　方法:制備宮頸癌荷瘤裸鼠動物模型。獲取瘤體組織后進行大體標本觀測，評價β-HIVS對裸鼠皮下移植腫瘤的抑制效果;HE染色法觀察細胞形態(tài)學變化;Tunel染色法檢測腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡狀態(tài);qRT-PCR、West

16、ern blot法檢測β-HIVS處理后PI3K、AKT、mTOR、P70S6K的mRNA和蛋白表達的變化。
　　結(jié)果:1）β-HIVS治療組宮頸癌移植瘤生長速度明顯低于對照組，注射藥物后瘤體重量及體積縮小較對照組相比具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，β-HIVS治療組的抑瘤率達到32.80％。2)組織學HE染色顯示，β-HIVS治療組腫瘤細胞發(fā)生變性壞死，癌巢結(jié)構(gòu)疏松，核濃縮、碎裂，濃縮的染色質(zhì)圍繞于核周邊或形成新月體結(jié)構(gòu)。3）T

17、unel細胞凋亡原位檢測顯示，β-HIVS能誘導宮頸癌組織的腫瘤細胞發(fā)生凋亡。4）qRT-PCR檢測，經(jīng)β-HIVS治療后，移植瘤組織中PI3K、AKT、mTOR、P70s6K的mRNA表達均低于對照組(p＜0.01)。Western blot檢測，經(jīng)β-HIVS治療后，PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和P70s6K的蛋白表達水平均明顯下降(p＜0.01)。
　　結(jié)論:β-HIVS通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖對宮頸癌移植瘤