小鼠眼球發(fā)育及神經酰胺作用機制的研究.pdf

1、脊柱類動物的眼因其功能是一個非常特殊的器官,因其特殊的結構和屈光系統(tǒng)一直是神經發(fā)育學學科中的研究熱點。眼睛是由幾個胚層來源的不同部分,經過一系列的誘導作用和時間,空間上的協(xié)調,所形成的一個具有精確功能的器官。眼的發(fā)育主要包括角膜、晶狀體及視網膜發(fā)育,發(fā)育過程與神經細胞的遷移、增殖、分化密切相關。本課題選用C57BL/6J小鼠,對E8至P180年齡段的正常小鼠的角膜、晶狀體及視網膜發(fā)育過程中神經干細胞的增殖,神經細胞的分化,細胞的凋亡以及

2、重要調控蛋白的表達進行了系統(tǒng)的研究。另外,有研究表明,神經鞘磷脂合成酶2基因敲除(sphingomyelin synthase2 knockout,SMS2-/-)會造成體內神經酰胺的堆積,神經酰胺的堆積是否會影響小鼠視網膜神經細胞增殖與雙極細胞的發(fā)育,有關這方面的研究較少。本課題選用SMS2-/-小鼠,應用免疫細胞化學及BrdU標記增殖細胞技術,對該問題進行研究,這將有助于我們深入理解視網膜的發(fā)育及神經酰胺的作用機制。
　　目的

3、:探討角膜細胞的增殖與凋亡對角膜結構修復與塑形的作用;探討晶狀體細胞增殖對晶狀體發(fā)生的作用及其與細胞周期之間的關系,研究 Synaptophysin蛋白在晶狀體發(fā)生過程中的作用;探討視網膜細胞增殖與細胞周期之間的關系,以及視網膜神經細胞分化和突觸連接形成對感光信息傳遞的作用;探討神經酰胺堆積對視網膜發(fā)育的影響。
　　方法:本課題應用HE染色、免疫熒光和BrdU技術等技術對胚胎和出生后小鼠角膜、晶狀體、視網膜進行形態(tài)學觀察,對視網膜

4、BrdU和CyclinD1陽性細胞密度進行測量。
　　結果:1.小鼠角膜的發(fā)生與細胞凋亡
　　胚胎發(fā)育及出生后早期,角膜以實質層的發(fā)育為主。P14左右,角膜上皮細胞層開始增殖分化為兩層細胞,同時內皮細胞也開始分化。至P30時,我們可以辨別出角膜的六層結構。BrdU陽性細胞主要存在實質層中成纖維細胞,出生以后也可見于角膜上皮細胞層和內皮細胞層。隨著角膜發(fā)育,P10左右,其它層的BrdU陽性細胞都消失,僅存在于角膜上皮細胞層。P

5、CNA陽性細胞在發(fā)育早期散在分布在角膜的各層,P14以后PCNA陽性細胞均勻的分布在角膜上皮細胞的基底層,并維持在穩(wěn)定狀態(tài)。在角膜發(fā)育早期,在各層可見許多細胞凋亡。
　　2.小鼠晶狀體發(fā)育過程中細胞增殖及Synaptophysin蛋白的表達
　　E8左右,晶狀體由最初的晶狀體板分化而來,是由單層柱狀上皮細胞圍成的空泡,空泡再進一步分化,被原始晶狀體纖維所替代,逐漸形成晶狀體;BrdU和PCNA的陽性細胞主要分布在晶狀體上皮細

6、胞的前囊中央區(qū),但P10以后BrdU陽性細胞已不在晶狀體上皮細胞分布,而PCNA持續(xù)表達。Cyclin D1陽性細胞在胚胎期主要在晶狀體上皮細胞的赤道部表達,出生早期在晶狀體上皮細胞的前囊中央區(qū),P5以后在赤道前區(qū)分布,赤道部有少量陽性細胞;在晶狀體發(fā)育過程中,Synaptophysin可以在晶狀體的基質中和赤道部的胞體中發(fā)現(xiàn)。
　　3.小鼠視網膜神經細胞的分化與突觸的形成
　　胚胎及出生后早期,Sox2和Cyclin D1

7、主要分布在神經母細胞層和神經節(jié)細胞層, P5以后隨著DCX遷移至內顆粒層,Sox2在P10以后未見分布,Cyclin D1在P14以后未見分布;神經節(jié)細胞是最早產生和分化成熟的神經元,然后是水平細胞、視錐視桿細胞、無長突細胞、雙極細胞,其中,DCX在水平細胞中表達,在胚胎期及出生后早期, DCX在神經母細胞層標記的是未成熟的水平細胞;在胚胎期及出生早期SYN分布在神經母細胞層的中外三分之一處,隨著小鼠的發(fā)育,SYN最終分布在外網層與水平

8、細胞的接壤處。同時SYN持續(xù)在內網層表達。
　　4. WT和SMS2-/-仔鼠視網膜發(fā)育情況比較
　　對WT和SMS2-/-仔鼠小鼠視網膜內BrdU和PKC-α陽性細胞數進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)BrdU和PKC-α陽性細胞密度無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義,P>0.05。
　　結論:①首先在角膜的發(fā)育過程中,角膜的發(fā)育與其感光功能形成的過程相一致,角膜干細胞的增殖與其修復有關;有大量的凋亡細胞參與角膜結構的塑形。②其次在晶狀體的發(fā)

9、育過程中,細胞增殖對晶狀體發(fā)育和晶狀體的修復起著重要的作用;細胞周期蛋白 Cyclin D1可能參與到調控赤道部細胞的消失,因此晶狀體的透明度可以保持;Synaptophysin在晶狀體的表達說明了它對晶狀體的透明有著重要的作用,通過調控鈣離子內流入胞體和基質中。③最后在視網膜的整個發(fā)育過程中,Cyclin D1細胞周期蛋白與 Sox2轉錄因子調節(jié)視網膜祖細胞的增殖分化,確保在開眼時視網膜祖細胞分化成視網膜的各個神經元,保證視網膜神經元