小鼠眼球發(fā)育及神經(jīng)酰胺作用機(jī)制的研究.pdf

1、脊柱類動物的眼因其功能是一個非常特殊的器官,因其特殊的結(jié)構(gòu)和屈光系統(tǒng)一直是神經(jīng)發(fā)育學(xué)學(xué)科中的研究熱點(diǎn)。眼睛是由幾個胚層來源的不同部分,經(jīng)過一系列的誘導(dǎo)作用和時間,空間上的協(xié)調(diào),所形成的一個具有精確功能的器官。眼的發(fā)育主要包括角膜、晶狀體及視網(wǎng)膜發(fā)育,發(fā)育過程與神經(jīng)細(xì)胞的遷移、增殖、分化密切相關(guān)。本課題選用C57BL/6J小鼠,對E8至P180年齡段的正常小鼠的角膜、晶狀體及視網(wǎng)膜發(fā)育過程中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,神經(jīng)細(xì)胞的分化,細(xì)胞的凋亡以及

2、重要調(diào)控蛋白的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。另外,有研究表明,神經(jīng)鞘磷脂合成酶2基因敲除(sphingomyelin synthase2 knockout,SMS2-/-)會造成體內(nèi)神經(jīng)酰胺的堆積,神經(jīng)酰胺的堆積是否會影響小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞增殖與雙極細(xì)胞的發(fā)育,有關(guān)這方面的研究較少。本課題選用SMS2-/-小鼠,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)及BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞技術(shù),對該問題進(jìn)行研究,這將有助于我們深入理解視網(wǎng)膜的發(fā)育及神經(jīng)酰胺的作用機(jī)制。
　　目的

3、:探討角膜細(xì)胞的增殖與凋亡對角膜結(jié)構(gòu)修復(fù)與塑形的作用;探討晶狀體細(xì)胞增殖對晶狀體發(fā)生的作用及其與細(xì)胞周期之間的關(guān)系,研究 Synaptophysin蛋白在晶狀體發(fā)生過程中的作用;探討視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期之間的關(guān)系,以及視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化和突觸連接形成對感光信息傳遞的作用;探討神經(jīng)酰胺堆積對視網(wǎng)膜發(fā)育的影響。
　　方法:本課題應(yīng)用HE染色、免疫熒光和BrdU技術(shù)等技術(shù)對胚胎和出生后小鼠角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,對視網(wǎng)膜

4、BrdU和CyclinD1陽性細(xì)胞密度進(jìn)行測量。
　　結(jié)果:1.小鼠角膜的發(fā)生與細(xì)胞凋亡
　　胚胎發(fā)育及出生后早期,角膜以實(shí)質(zhì)層的發(fā)育為主。P14左右,角膜上皮細(xì)胞層開始增殖分化為兩層細(xì)胞,同時內(nèi)皮細(xì)胞也開始分化。至P30時,我們可以辨別出角膜的六層結(jié)構(gòu)。BrdU陽性細(xì)胞主要存在實(shí)質(zhì)層中成纖維細(xì)胞,出生以后也可見于角膜上皮細(xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層。隨著角膜發(fā)育,P10左右,其它層的BrdU陽性細(xì)胞都消失,僅存在于角膜上皮細(xì)胞層。P

5、CNA陽性細(xì)胞在發(fā)育早期散在分布在角膜的各層,P14以后PCNA陽性細(xì)胞均勻的分布在角膜上皮細(xì)胞的基底層,并維持在穩(wěn)定狀態(tài)。在角膜發(fā)育早期,在各層可見許多細(xì)胞凋亡。
　　2.小鼠晶狀體發(fā)育過程中細(xì)胞增殖及Synaptophysin蛋白的表達(dá)
　　E8左右,晶狀體由最初的晶狀體板分化而來,是由單層柱狀上皮細(xì)胞圍成的空泡,空泡再進(jìn)一步分化,被原始晶狀體纖維所替代,逐漸形成晶狀體;BrdU和PCNA的陽性細(xì)胞主要分布在晶狀體上皮細(xì)

6、胞的前囊中央?yún)^(qū),但P10以后BrdU陽性細(xì)胞已不在晶狀體上皮細(xì)胞分布,而PCNA持續(xù)表達(dá)。Cyclin D1陽性細(xì)胞在胚胎期主要在晶狀體上皮細(xì)胞的赤道部表達(dá),出生早期在晶狀體上皮細(xì)胞的前囊中央?yún)^(qū),P5以后在赤道前區(qū)分布,赤道部有少量陽性細(xì)胞;在晶狀體發(fā)育過程中,Synaptophysin可以在晶狀體的基質(zhì)中和赤道部的胞體中發(fā)現(xiàn)。
　　3.小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的分化與突觸的形成
　　胚胎及出生后早期,Sox2和Cyclin D1

7、主要分布在神經(jīng)母細(xì)胞層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層, P5以后隨著DCX遷移至內(nèi)顆粒層,Sox2在P10以后未見分布,Cyclin D1在P14以后未見分布;神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是最早產(chǎn)生和分化成熟的神經(jīng)元,然后是水平細(xì)胞、視錐視桿細(xì)胞、無長突細(xì)胞、雙極細(xì)胞,其中,DCX在水平細(xì)胞中表達(dá),在胚胎期及出生后早期, DCX在神經(jīng)母細(xì)胞層標(biāo)記的是未成熟的水平細(xì)胞;在胚胎期及出生早期SYN分布在神經(jīng)母細(xì)胞層的中外三分之一處,隨著小鼠的發(fā)育,SYN最終分布在外網(wǎng)層與水平

8、細(xì)胞的接壤處。同時SYN持續(xù)在內(nèi)網(wǎng)層表達(dá)。
　　4. WT和SMS2-/-仔鼠視網(wǎng)膜發(fā)育情況比較
　　對WT和SMS2-/-仔鼠小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)BrdU和PKC-α陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)BrdU和PKC-α陽性細(xì)胞密度無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P>0.05。
　　結(jié)論:①首先在角膜的發(fā)育過程中,角膜的發(fā)育與其感光功能形成的過程相一致,角膜干細(xì)胞的增殖與其修復(fù)有關(guān);有大量的凋亡細(xì)胞參與角膜結(jié)構(gòu)的塑形。②其次在晶狀體的發(fā)

9、育過程中,細(xì)胞增殖對晶狀體發(fā)育和晶狀體的修復(fù)起著重要的作用;細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D1可能參與到調(diào)控赤道部細(xì)胞的消失,因此晶狀體的透明度可以保持;Synaptophysin在晶狀體的表達(dá)說明了它對晶狀體的透明有著重要的作用,通過調(diào)控鈣離子內(nèi)流入胞體和基質(zhì)中。③最后在視網(wǎng)膜的整個發(fā)育過程中,Cyclin D1細(xì)胞周期蛋白與 Sox2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的增殖分化,確保在開眼時視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜的各個神經(jīng)元,保證視網(wǎng)膜神經(jīng)元