水稻神經(jīng)酰胺激酶基因OsCERK的克隆及功能分析.pdf

1、鞘脂(sphingolipids)除了作為真核生物中膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分外,在細(xì)胞的生長、分化、增殖、衰老及細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用。雖然植物鞘脂在程序性細(xì)胞死亡、植物抗病防御及信號傳導(dǎo)中的作用也逐漸被人們所認(rèn)識,但是,目前對植物鞘脂的了解仍然很有限。水稻(Oryza sativa L.)作為最重要的糧食作物之一,已成為單子葉植物研究的模式植物。水稻鞘脂代謝相關(guān)基因的研究,對.丁水稻抗病育種及性狀的遺傳改良具有重要的理論與應(yīng)用價值。

2、本文采用生物化學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等方法對水稻鞘脂代謝途徑中的重要酶之一神經(jīng)酰胺激酶(OsCERK)的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步分析,為弄清植物中鞘脂的作用提供了重要的參考。
　　 1)首先,采用RT-PCR及RACE方法克隆得到水稻神經(jīng)酰胺激酶候選基因的全長cDNA序列。預(yù)測分析表明,3'端具有串聯(lián)的多聚腺苷酸加入位點,但并不影響其編碼框,該基因編碼607aa,是一個略偏酸性的蛋白；OsCERK序列中含有PH區(qū)域、保守的CXX

3、XCXXC基序以及二?；视图っ复呋瘏^(qū)域,還含有多個豆蔻酰基化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸位點和依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點。通過CLUSTALW比對,并用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,CERK蛋白能很明顯的聚成脊椎動物、無脊椎動物及植物幾大類,而與CERK同源的鞘氨醇激酶及二酰基甘油激酶單獨聚成微生物一類,推測CERK基因可能由LCB激酶或二酰甘油激酶基因進(jìn)化而來,且CERK基因可能與植物的登陸及

4、登陸后對環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。
　　 其次,通過半定量PCR和提取物的酶活性分析檢測OsCERK基因表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)OsCERK基因主要在水稻葉片中表達(dá),在根中表達(dá)很弱。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)和聚乙二醇介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化水稻原牛質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)在HEK293和COS-7細(xì)胞中C端GFP標(biāo)記的OsCERK蛋白都均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)中；在水稻原生質(zhì)體中N端DsRed標(biāo)記的OsCERK蛋白主要定位在類似葉綠體和線粒體的細(xì)胞

5、器中,這為進(jìn)一步分析OsCERK基因的功能提供重要的線索。
　　 此外,體外分析重組蛋白OsCERK的生化特性表明,其最適的反應(yīng)溫度和pH值分別為40℃和7:蛋白的酶活性反應(yīng)顯示出典型的米曼氏動力學(xué)關(guān)系,且鎂離子能有效增強(qiáng)其神經(jīng)酰胺激酶活性,而鈣離子對其作用并不明顯；同時,應(yīng)用特異的神經(jīng)酰胺激酶抑制劑,發(fā)現(xiàn)重組OsCERK能被所用的抑制劑有效抑制,這進(jìn)一步確認(rèn)了神經(jīng)酰胺激酶的活性。對OsCERK保守基序CXXXCXXC中三個半胱

6、氨酸分別突變的研究表明,此三個半胱氨酸對神經(jīng)酰胺激酶的活性非常重要。
　　 最后,OsCERK基因互補擬南芥神經(jīng)酰胺激酶突變體acd5的實驗表明,所獲得的純合轉(zhuǎn)OsCERK基因植株的表型與野生型一致,說明OsCERK基因互補了acd5的突變體表型。同時檢測了植株在發(fā)育的各個時期PR1基因的表達(dá)、植株對細(xì)菌Pseudomonase syringae侵染的反應(yīng)以及植株葉片提取物神經(jīng)酰胺激酶的活性,實驗結(jié)果都表明,OsCERK完全互補