載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束的抗肝癌作用研究.pdf

1、本課題成功設(shè)計了載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束(SCM)，它將具有治療作用的鹽霉素(SAL)包載于載體聚乙二醇-神經(jīng)酰胺（PEG-CRM）形成的膠束內(nèi)，以同時殺傷肝癌細胞和肝癌干細胞。由于可提高SAL的水溶性和載體對普通肝癌細胞的殺傷能力的增強作用，加之膠束的滲透性使得更多的SAL靶向到腫瘤部位，為肝癌的治療提供新的策略。
　　首先，利用高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法建立鹽霉素的體內(nèi)外檢測方法學(xué)，并考察方法學(xué)的專屬性、線性、精密度和

2、準確度等，為SAL的體內(nèi)外測定提供基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，該方法測定SAL具有特異性，且在7.8～1000μg/mL的濃度范圍內(nèi)，SAL的濃度(C)與峰面積(A)呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為A=1012.4C+7115.6(R2=0.9999)。本課題所建立的高效液相色譜法所測得的SAL的精密度和準確度變動范圍均在3％之內(nèi)，表明該方法學(xué)可用于測定SAL的濃度，符合實驗的要求。以非諾貝特(FNBT)為內(nèi)標建立測定體內(nèi)SAL的LC-MS檢測方

3、法，線性范圍為20～1000ng/mL時，線性回歸方程為A=0.005995C-0.01851，R2=0.999，定量下限為20ng/mL。當(dāng)S/N≥3時，SAL的最低檢測限為4 ng/mL，可滿足實驗的要求。
　　其次，主要考察鹽霉素和聚乙二醇-神經(jīng)酰胺對腫瘤細胞和腫瘤干細胞的殺傷毒性。我們選取的是肝癌HepG2細胞系以及通過懸浮狀態(tài)培養(yǎng)形成的HepG2微球體。大量培養(yǎng)HepG2細胞并考察SAL和PEG-ceramide兩種藥物

4、在HepG2細胞系的相互作用，即將兩種游離藥物分別以1∶2，1∶3，1∶4三種摩爾比例混合，對HepG2肝癌細胞進行殺傷，篩選得到游離SAL和PEG-ceramide兩者聯(lián)用比例為1∶4或1∶2(mol/mol)時，對HepG2細胞殺傷效果較好。隨后制備兩種藥載比的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束，對HepG2細胞及其微球體進行殺傷，發(fā)現(xiàn)兩種藥載比膠束的殺傷效果無顯著性差異，但是考慮到鹽霉素的毒性，最終確定1∶4為SAL和PEG-ceramide

5、兩藥聯(lián)合作用的最佳協(xié)同比例。
　　第三，利用薄膜分散法制備上述優(yōu)化比例的載鹽霉素的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束，并對其理化性質(zhì)，包括粒徑、Zeta電位、臨界膠束濃度(CMC)、包封率、載藥量及體外釋放度進行考察，發(fā)現(xiàn)所制備的載藥膠束粒徑為11.02±2.34nm，Zeta電位為-5.66±0.77mV，臨界膠束濃度值為7.94μg/mL，包封率和載藥量分別為76.74±4.05％和6.32±0.57％，在中性條件下48h累計釋放率為65

6、％，表現(xiàn)出一定的緩釋特性。用透射電鏡觀察其形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其大小均一，分散均勻且無粘連。
　　第四，我們將上述制備的優(yōu)化比例的載藥膠束(SCM)進行了體外細胞學(xué)考察，包括采用CCK-8(Cell Counting Kit-8，細胞計數(shù)試劑盒)法測定膠束對HepG2細胞及其微球體的毒性，Annexin V-FITC/PI雙染法考察肝癌HepG2細胞和微球體的凋亡，克隆形成實驗、微球體形成率實驗測定HepG2細胞及其微球體給藥后各組肝癌細胞

7、的增殖能力以及利用激光共聚焦儀器考察肝癌HepG2細胞、HepG2-TS及HepG2-TS單細胞懸液對載熒光物質(zhì)的聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束的攝取能力。結(jié)果表明，將SAL以1∶4的藥載比包裹于PEG-ceramide膠束中較游離SAL對HepG2細胞以及微球體的細胞殺傷作用更強，誘導(dǎo)細胞凋亡及抑制細胞增殖的能力更強，而且，由實驗結(jié)果可知，HepG2細胞及HepG2-TS對載熒光物質(zhì)PECF的PEG-ceramide膠束的攝取能力更強，進一步

8、表明聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束具有較強的靶向肝癌細胞和肝癌干細胞的能力。
　　最后，我們對新制備的載藥膠束進行了體內(nèi)動物實驗的考察。首先考察膠束載體對BALB/C小鼠的安全性，即小鼠尾靜脈給藥后，對小鼠心、肝、脾、肺、腎做CD68免疫組化和HE染色，并對小鼠血液進行血常規(guī)分析，結(jié)果表明膠束載體僅對小鼠肝和腎產(chǎn)生輕微的毒性，且具有一過性，具備用藥安全特性。其次，制備包載熒光探針Dir的PEG-ceramide膠束，通過建立HepG2荷瘤

9、裸鼠模型，評價熒光膠束在動物體內(nèi)的分布和腫瘤靶向性，結(jié)果表明載Dir熒光物質(zhì)的膠束主要分布在肝和腫瘤中，且在腫瘤部位有更多的蓄積，具有很強的腫瘤靶向和腫瘤滲透性。隨后制備腫瘤冰凍切片以期探討載PECF熒光染料膠束的靶向性，結(jié)果顯示載PECF的熒光膠束在腫瘤部位的熒光強度最大，靶向性最好。接著利用LC-MS分析載藥膠束在SD大鼠體內(nèi)有關(guān)鹽霉素的藥動學(xué)特征，結(jié)果顯示載藥聚乙二醇-神經(jīng)酰胺膠束(SCM)和載藥DSPE-PEG膠束(SDM)均可