神經(jīng)酰胺在酒精性肝病發(fā)病機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)為長期大量酒精攝入或短期過量飲酒所致的肝臟疾病，其初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，嚴(yán)重者可進(jìn)展至脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化。酒精引起肝功能損傷的具體機(jī)制尚不十分明確，目前有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺（ceramide）參與到其發(fā)病過程中。神經(jīng)酰胺屬于鞘磷脂類，參與構(gòu)成生物膜，并為鞘磷脂信號(hào)途徑中重要的第二信使，能夠激活多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶如蛋白磷酸酶2A(protein ph

2、osphatase2A，PP2A)，調(diào)節(jié)凋亡、增殖等信號(hào)過程。乙醇激活酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASMase)后，使神經(jīng)酰胺生成增多，通過蛋白磷酸酶2A影響腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphate activated protein kinase，AMPK)，使活化的AMPK去磷酸化失活，進(jìn)而影響到下游一系列脂代謝調(diào)節(jié)基因，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積。本研究采用酒精灌胃方式建立大鼠ALD

3、模型，通過分子生物學(xué)方法探討神經(jīng)酰胺、酸性鞘磷脂酶及蛋白磷酸酶2A在酒精性肝病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:選擇健康雄性Wistar大鼠50只，體重180-220g，經(jīng)過正常喂養(yǎng)1周之后，隨機(jī)分配10只作為正常對(duì)照組，其余大鼠作為模型組每日灌入酒精，并分別在第4周、8周、12周和16周末處死模型組大鼠10只、9只、8只和8只。取出大鼠肝臟后，用4％中性甲醛溶液固定一部分肝組織，經(jīng)石蠟包埋后切片，行蘇木素-伊紅(hematoxyli

4、n-eosin，HE)染色以觀察其病理改變，其余組織-80℃保存待用。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(Real Time-quantitative PolymeraseChain Reaction，RT-qPCR)法檢測ASMase、PP2A的mRNA表達(dá)水平，免疫組化技術(shù)、Western-blot檢測ASMase、PP2A的蛋白表達(dá)水平。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)檢測肝組織神經(jīng)酰胺含量。
　　結(jié)果:

5、r>　　1肝臟組織病理學(xué)改變:4周大鼠肝細(xì)胞可見脂肪變性，至8周、12周，脂肪變加重，炎癥增多并伴隨纖維組織增生，至16周，肝細(xì)胞呈彌漫小泡性脂變，可見肝竇周圍纖維化、匯管區(qū)的纖維組織增生，并觀察到已形成的纖維間隔。
　　2免疫組化技術(shù)檢測各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平:正常組大鼠肝組織中ASMase、PP2A陽性表達(dá)較少，酒精模型組陽性表達(dá)量呈增加趨勢(shì)。
　　3 RT-qPCR法檢測各指標(biāo)mRNA表達(dá)的變化:正常組大鼠肝組織中ASMa

6、se、PP2A mRNA表達(dá)量較少，酒精模型組mRNA表達(dá)量逐漸增加，與正常對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。
　　4 Western-blot檢測各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化:正常組大鼠肝組織中ASMase、 PP2A蛋白表達(dá)量較少，酒精模型組表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　5高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測肝組織中神經(jīng)酰胺的含量:酒精模型組大鼠肝內(nèi)神經(jīng)酰胺含量逐漸增加