MiR-492調(diào)控CD147表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T奧沙利鉑耐藥性的影響的研究.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌是男性第三位、女性第二位高發(fā)的腫瘤?；熓强拱┲委煹闹匾侄?。奧沙利鉑屬含1，2二氨環(huán)己烷(DACH)的鉑類藥物，廣泛用于治療對(duì)順鉑耐藥的腫瘤。在歐洲，奧沙利鉑已被準(zhǔn)許作為一線藥物治療結(jié)直腸癌。在目前結(jié)腸癌的化療過程中，盡管靶向抗癌治療的發(fā)展已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，對(duì)奧沙利鉑耐藥趨勢(shì)日益增加，化療藥物耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)是抗腫瘤治療的主要瓶頸。尋找有效對(duì)抗奧沙利鉑耐藥的方案已成為目前結(jié)腸癌治療的關(guān)鍵問題之一
　　已

2、研究資料表明，針對(duì)化療耐藥的靶向治療有望成為提高療效的重要策略?；诖嗽?，本研究建立了奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌LS174T/L-OHP細(xì)胞系，運(yùn)用該細(xì)胞系開展體外實(shí)驗(yàn)，可以簡(jiǎn)化并很好的模擬結(jié)腸癌對(duì)奧沙利鉑耐藥的發(fā)展。利用此細(xì)胞系深入研究耐藥的分子機(jī)制，可能有助于發(fā)展有效治療方式，將耐藥腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為對(duì)化療敏感的細(xì)胞。進(jìn)而發(fā)展新型靶向治療，攻克腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥的問題，這也正是目前結(jié)腸癌治療的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　CD147是一個(gè)高度糖基化的

3、蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，在細(xì)胞間識(shí)別中起著關(guān)鍵的作用。最近研究結(jié)果指出，CD147可能對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為起著重要的調(diào)控作用，其中CD147對(duì)化療耐藥的影響提示其可能參與調(diào)節(jié)化療耐藥的機(jī)制。CD147可能成為現(xiàn)今腫瘤治療的潛在治療靶點(diǎn)。
　　MicroRNAs（簡(jiǎn)稱miRNAs）是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA小分子。大量研究數(shù)據(jù)表明miRNAs表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)，所調(diào)控的基因涉及許多重要的細(xì)胞

4、生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等，提示它們可能在腫瘤發(fā)展中扮演致瘤或抑瘤的角色，研究顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-492可抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力，提示miR-492對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用?；谶@些研究，我們推測(cè)miR-492可能通過調(diào)控CD147表達(dá)，在結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥過程中扮演重要角色。本研究通過開展體內(nèi)外細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，旨在闡明miR-492/CD147軸在結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的關(guān)鍵功能調(diào)控作用。研究結(jié)果提示

5、miR-492通過調(diào)節(jié)CD147，促進(jìn)結(jié)腸癌對(duì)奧沙利鉑的耐藥。CD147可能成為對(duì)抗結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的一個(gè)新型治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.建立LS174T/L-OHP耐藥細(xì)胞系
　　本實(shí)驗(yàn)所采用的方法是逐步遞增培養(yǎng)液中L-OHP濃度、間歇作用于LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo)篩選而獲得。應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)倍比稀釋濃度的L-OHP對(duì)其細(xì)胞的抑制率，進(jìn)而確認(rèn)所建立細(xì)胞系具有良好的耐藥性和穩(wěn)定性。
　　

6、2.分析MiR492/CD147在結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T及耐藥細(xì)胞LS174T/L-OHP中的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)PCR分析LS174T/L-OHP和LS174T細(xì)胞內(nèi)miR-492和CD147的mRNA表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)LS174T/L-OHP和LS174T細(xì)胞中CD147的表達(dá)水平。揭示miR-492/CD147可能參與結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑耐藥的過程。
　　3.敲低LS174T/L-OHP細(xì)胞C

7、D147表達(dá)對(duì)LS174T/L-OHP細(xì)胞耐藥性的影響
　　RNA干擾技術(shù)敲低LS174T/L-OHP細(xì)胞CD147表達(dá)后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)LS174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性的影響。
　　4.下調(diào)LS174T/L-OHP細(xì)胞中miR492表達(dá)對(duì)CD147蛋白水平的影響
　　采用miRNA抑制體轉(zhuǎn)染LS174T/L-OHP細(xì)胞的方法，下調(diào)LS174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492的表達(dá)對(duì)CD147蛋白水平

8、的影響。
　　5.上調(diào)LS174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492表達(dá)對(duì)CD147蛋白水平的影響
　　轉(zhuǎn)染pre-miR-492外源性上調(diào)miR-492，檢測(cè)LS174T/L-OHP細(xì)胞中CD147蛋白含量，雙熒光素酶檢測(cè)CD1473'-UTR的啟動(dòng)子熒光素酶活性，進(jìn)而MTT法檢測(cè)LS174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用裸鼠腫瘤耐藥細(xì)胞，外源性上調(diào)miR-492，檢測(cè)其對(duì)CD147的調(diào)控作用

9、，同時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤體積來(lái)揭示miR-492/CD147對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。
　　結(jié)果:
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞相比，奧沙利鉑耐藥細(xì)胞LS174T/L-OHP中miR-492的表達(dá)水平較低，CD147的表達(dá)水平則更高。在LS174T/L-OHP中，我們還發(fā)現(xiàn)敲低CD147可以增強(qiáng)LS174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。采用miRNA抑制體轉(zhuǎn)染LS174T/L-OHP細(xì)胞的方法，下調(diào)LS1

10、74T/L-OHP細(xì)胞中miR-492的表達(dá)，CD147表達(dá)水平升高;外源性導(dǎo)入pre-miR-492上調(diào)miR-492，可以下調(diào)CD147的表達(dá)水平，同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。此外，給奧沙利鉑耐藥移植瘤注入miR-492，能夠提高耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的響應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.LS174T/L-OHP耐藥細(xì)胞系的建立具有良好的耐藥性和穩(wěn)定性。
　　2.LS174T/L-OHP細(xì)胞中miR-492水平下調(diào)，CD1

11、47的蛋白和mRNA表達(dá)水平均上調(diào)。
　　3.CD147表達(dá)水平和LS174T/L-OHP細(xì)胞耐藥性相關(guān)，敲低LS174T/L-OHP細(xì)胞CD147可以增強(qiáng)LS174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。
　　4.miR-492可以通過對(duì)CD147表達(dá)的直接調(diào)控，改變奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌LS174T/L-OHP細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。
　　5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在結(jié)腸癌細(xì)胞中，表達(dá)外源性的miR-492，可以降低細(xì)胞對(duì)奧