增齡和預(yù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在小鼠帕金森發(fā)病中的作用：線粒體與自噬途徑的分子生理學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、目的：帕金森病(PD)是嚴(yán)重威脅中老年人群的神經(jīng)變性性疾病。最近研究表明自噬在清除與神經(jīng)變性疾病相關(guān)的細(xì)胞器方面起關(guān)鍵作用,尤其在PD的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,但其相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究以增齡小鼠為模型,通過腹腔注射MPTP建立PD模型,研究自噬的增齡性改變對(duì)MPTP毒性機(jī)制的影響,及其與線粒體功能,線粒體動(dòng)力學(xué)變化之間的關(guān)系;同時(shí)選取青年小鼠進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練,6周后建立PD模型,探討運(yùn)動(dòng)預(yù)訓(xùn)練對(duì)PD小鼠以上各項(xiàng)指標(biāo)的影響;

2、建立MPP+誘導(dǎo)的離體PC12細(xì)胞PD模型,使用藥物調(diào)控自噬水平,探究自噬與PD,自噬與線粒體動(dòng)力學(xué)和線粒體功能的關(guān)系。
　　方法：
　　1、90只雄性C57BL/6小鼠分為6組:4月齡對(duì)照組(4MC)、4月PD模型組(4MP)、8月齡對(duì)照組(8MC)、8月齡PD模型組(8MP)、15月齡對(duì)照組(15MC)和15月齡PD模型組(15MP),每組15只。注射MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)(30mg/k

3、g×2次,ip,間隔16小時(shí))制作PD模型。自然增齡組動(dòng)物在相同時(shí)間以同方式接受同等劑量的生理鹽水。觀察各組小鼠行為學(xué)(懸掛、爬桿)變化;免疫組織化學(xué)法計(jì)數(shù)黑質(zhì)酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞數(shù);透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變;Oxytherm液相氧電極測(cè)定小鼠中腦和紋狀體線粒體功能(態(tài)3呼吸、態(tài)4呼吸、RCR);熒光素-熒光素酶發(fā)光法測(cè)定ATP酶合成活力;熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體ROS生成速率;Western-blot法測(cè)定線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白(

4、Mfn2,Fis1,Drp1)和自噬相關(guān)蛋白(Beclin1,LC3-II)表達(dá)。
　　2、雄性C57BL/6小鼠(6-8周),隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行連續(xù)6周,每周6天、每天20分鐘、12米/分(75％VO2max)的跑臺(tái)訓(xùn)練。兩組再隨機(jī)分成兩組,于訓(xùn)練結(jié)束后第1天分別注射生理鹽水或中等劑量MPTP造模,最后分為安靜+生理鹽水組(N)、運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組(EN)、安靜+MPTP(P)、預(yù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+MPTP(EP)4組,每

5、組15只。熒光定量PCR方法檢測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白(Mfn2,Fis1,Drp1)和自噬相關(guān)蛋白(Beclin1,LC3)基因表達(dá);ELASIA法檢測(cè)小鼠血清,中腦和紋狀體中GDNF含量。其余檢測(cè)指標(biāo)同前。
　　3、使用250μMMPP+孵育PC12細(xì)胞48小時(shí)建立細(xì)胞PD模型,雷帕霉素和渥蔓青霉素終濃度分別為0.2μg/ml、1μg/ml,均于MPP+孵育結(jié)束前30分鐘加入。實(shí)驗(yàn)分組為:空白對(duì)照組(C)、單獨(dú)雷帕霉素處理組(C

6、R)、單獨(dú)渥蔓青霉素處理(CW)、MPP+處理組(P)、MPP++雷帕霉素處理組(PR)、MPP++渥蔓青霉素處理組(PW)。檢測(cè)各組細(xì)胞存活率及丙二醛含量;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);構(gòu)建GFP-LC3質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,激光共聚焦顯微鏡觀察自噬發(fā)生情況;利用激光共聚焦顯微鏡和特異性熒光染料檢測(cè)各組線粒體膜通道孔開放程度(mPTP)及線粒體膜電位變化;Western-blot法檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白(Beclin1,LC3-II)以及線粒體

7、動(dòng)力學(xué)蛋白(OPA1,Fis1,Drp1)表達(dá)。
　　4、采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。行為學(xué)測(cè)試評(píng)分各組間進(jìn)行重復(fù)測(cè)量多因素方差分析。組間比較采用雙因素方差分析,組內(nèi)比較采用單因素方差分析。P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、增齡進(jìn)程中,與4MC組小鼠相比,8MC組小鼠除體重,Fis1和LC3-II蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.05)外,其余各項(xiàng)指標(biāo)變化無顯著性;與4M

8、C組小鼠相比,15MC組小鼠,黑質(zhì)細(xì)胞數(shù),態(tài)3呼吸,RCR,ATP酶合成活力和Mfn2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05),ROS生成速率,Fis1,Drp1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),Beclin1,LC3-II蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01);三組小鼠行為學(xué)測(cè)試以及態(tài)4呼吸無顯著性改變。使用MPTP造模后,與正常對(duì)照組相比,除小鼠體重和態(tài)4呼吸無顯著性改變外,其余指標(biāo)變化具有

9、顯著性,小鼠行為學(xué)測(cè)試評(píng)分,黑質(zhì)細(xì)胞數(shù),態(tài)3呼吸,RCR,ATP酶合成活力和Mfn2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01),ROS生成速率,Fis1,Drp1,Beclin1,LC3-II蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與4MP組小鼠相比,8MP小鼠變化同正常增齡過程相似,而與4MP和8MP相比15MP組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)顯著改變(P<0.01),并且15MP組較正常對(duì)照組相比Beclin1和LC3-II蛋白上升的幅度較低。組間方差分析表明增齡和

10、MPTP造模對(duì)小鼠爬桿測(cè)試,黑質(zhì)細(xì)胞數(shù),態(tài)3呼吸,RCR,ATP酶合成活力,ROS生成速率,Fis1,Drp1,Beclin1,LC3-II蛋白表達(dá)等指標(biāo)的影響存在顯著的交互作用。即伴隨增齡進(jìn)程小鼠對(duì)MPTP的敏感性逐漸加強(qiáng),MPTP對(duì)老年小鼠的影響最為明顯。
　　2、與N組比較,P組小鼠行為學(xué)測(cè)試評(píng)分在造模后第2天顯著下降,第8天仍未恢復(fù),且小鼠黑質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01),細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯異常,中腦和紋狀體線粒體態(tài)3呼吸

11、,RCR和ATP酶合成活力顯著下降(P<0.01),ROS生成速率顯著升高(P<0.01),Mfn2基因蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01,P<0.05),Fis1,Drp1,Beclin1和LC3-II基因蛋白表達(dá)顯著升高。與P組相比,EP組小鼠行為學(xué)測(cè)試評(píng)分在造模后第2天顯著升高,第8天已恢復(fù)正常,小鼠黑質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01),細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷改善,EP組小鼠線粒態(tài)3呼吸,RCR和ATP酶合成活力顯著升高(P<0.01,P<0

12、.01,P<0.05),ROS生成速率顯著下降(P<0.01)Mfn2和Fis1基因和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01,P<0.05),Drp1基因和蛋白變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Beclin1、LC3基因表達(dá)顯著升高(P<0.01),Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。組間方差分析表明運(yùn)動(dòng)與MPTP造模對(duì)小鼠行為學(xué),黑質(zhì)細(xì)胞數(shù),態(tài)3呼吸,RCR,ROS生成速率,LC3-II蛋白表達(dá)等指標(biāo)的影響存在顯著的交互作用。與N組

13、相比,EP組小鼠血清中GDNF含量顯著升高(P<0.01),P組和EP組小鼠腦組織中GDNF含量顯著升高(P<0.01)。與P組相比,EP組小鼠血清和腦組織勻漿中GDNF含量均顯著升高(P<0.01)。
　　3、與C組相比,P組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損自噬泡增多,細(xì)胞存活率,線粒體膜電位,OPA1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05),MDA,mPTP開放程度,Beclin1,LC3-II,Fis1,Drp1蛋白表達(dá)

14、顯著升高(P<0.01);與P組相比,PR組細(xì)胞自噬泡明顯增多,自噬泡中線粒體數(shù)量顯著增加,細(xì)胞存活率,線粒體膜電位,Beclin1,LC3-II,Drp1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),Fis1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),MDA,mPTP開放程度顯著下降(P<0.01,P<0.05);與P組相比,PW組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷加劇,細(xì)胞存活率,線粒體膜電位,Beclin1,LC3-II,Fis1,Drp1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01

15、),MDA,mPTP開放程度,OPA1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。激光共聚焦觀察顯示經(jīng)MPP+處理后,細(xì)胞自噬水平提高,線粒體自噬發(fā)生增多。組間方差分析顯示MPP+造模與不同藥物干預(yù)對(duì)PC12細(xì)胞存活率,MDA含量,線粒體膜通道孔開放程度,線粒體膜電位,Beclin1,LC3-II,Fis1蛋白表達(dá)的影響具有顯著的交互作用。
　　結(jié)論：
　　1、增齡進(jìn)程中,ROS生成逐漸增多,線粒體呼吸功能

16、降低,線粒體趨向分裂,自噬能力下降,分裂異常的線粒體不能有效清除,導(dǎo)致中腦黑質(zhì)損傷加劇。
　　2、MPTP可損害小鼠中腦和紋狀體線粒體功能,使自噬水平代償性增高。伴隨著增齡進(jìn)程,小鼠中腦和紋狀體對(duì)MPTP敏感性增強(qiáng),老年小鼠對(duì)MPTP最為敏感。老年小鼠自噬代償能力不足,在遭受同樣的外界損害時(shí),異常線粒體不能被有效清除,進(jìn)而導(dǎo)致ROS生成增多,線粒體功能的進(jìn)一步下降,神經(jīng)元損傷最為嚴(yán)重。
　　3、運(yùn)動(dòng)使線粒體線粒體融合分裂處于