增齡和不同熱量飲食對(duì)大鼠腎臟自噬的影響.pdf

1、目的：目前我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì),衰老問(wèn)題已成為國(guó)家與社會(huì)面臨的重大問(wèn)題之一。因此,急需加深對(duì)腎臟衰老機(jī)制的認(rèn)識(shí)并探索延緩腎臟衰老的策略,從而減少老年腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前認(rèn)為衰老從本質(zhì)上是受損和缺陷細(xì)胞成分不斷在細(xì)胞內(nèi)聚集,最終引起細(xì)胞和組織生理功能下降,導(dǎo)致機(jī)體衰老。自噬(autophagy),即自我吞噬作用(autophagocytosis),是存在于真核生物細(xì)胞中的一種高度保守的、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的重要保護(hù)性機(jī)制。在生理

2、情況下,自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)少量受損的細(xì)胞器和大分子聚集物,因此,當(dāng)自噬受損傷或自噬缺陷時(shí),機(jī)體有可能出現(xiàn)衰老和衰老相關(guān)疾病。研究表明能量代謝異常與衰老的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。限制熱量攝入是已經(jīng)得到公認(rèn)的唯一可以延緩多個(gè)物種衰老速率,延長(zhǎng)平均和最大壽命的干預(yù)方法。但是,目前對(duì)于限制熱量攝入延緩衰老的分子機(jī)理還不很清楚。本研究擬通過(guò)觀察3,12和24月齡Fischer344大鼠腎臟自噬功能的改變,明確衰老對(duì)腎臟自噬功能的影響；同時(shí)探討高熱量飲食

3、和限制熱量攝入對(duì)老齡大鼠腎臟自噬功能的影響,這對(duì)于理解腎臟衰老和腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制以及探索延緩衰老相關(guān)腎臟疾病新的治療方案具有重要的意義。
　　 方法：⑴取3月齡、12月齡和24月齡大鼠(每組10只)的腎臟組織,用PAS染色檢測(cè)大鼠腎臟病理變化。用real time-PCR及Western blot,觀測(cè)自噬相關(guān)基因(autophagy related genes,Atg)LC3/Atg8、beclin-1/Atg6、At

4、g5、Atg7,溶酶體組織蛋白酶B以及泛素結(jié)合蛋白p62/SQSTM1和多聚泛素聚集體(polyubiquitin aggregates)的表達(dá)變化。用免疫組化法觀察DNA損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧烏苷(8-OHdG)在腎組織中的定位和表達(dá)。用免疫熒光法檢測(cè)8-OHdG和LC3在腎組織的定位和表達(dá)變化。分別用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性(SA—β-gal)染色方法和Western blot檢測(cè)SA-β-gal活性變化和衰老標(biāo)志蛋白p16。用透射

5、電鏡檢測(cè)腎臟細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)變化。⑵將3月齡雄性Fischer344大鼠63只隨機(jī)分為3組:①正常飲食組:26只,自由飲食飲水,；②熱量限制組:16只,限制至正常食量的70％；③高熱量飲食組:21只,自由進(jìn)食高熱量飼料。待大鼠飼養(yǎng)至24月齡時(shí),處死留取24小時(shí)尿液,取血。檢測(cè)血生化、腎功能(Scr、BUN)和尿蛋白/肌酐。大鼠處死時(shí),測(cè)量大鼠體重,身長(zhǎng),腎重。留取腎臟組織液氮凍存,OCT包埋和10％甲醛固定。分別用于檢測(cè)p16蛋白和SA

6、—β—gal、自噬相關(guān)蛋白Atg、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物丙二醛(MDA)和蛋白質(zhì)羰基,8-OHdG的變化,采用PAS染色檢測(cè)大鼠腎臟病理改變。
　　 結(jié)果：首先觀察了衰老過(guò)程中腎臟自噬功能的變化。①Western blot顯示,與3月齡和12月齡大鼠相比,24月齡大鼠腎臟中衰老標(biāo)志物p16表達(dá)水平顯著以及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性與3月齡、12月齡相比顯著增加。②Western blot顯示,與3月齡大鼠腎臟組織相比,24月齡

7、大鼠自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅰ隨增齡顯著降低,LC3-Ⅱ隨增齡變化不明顯。免疫熒光結(jié)果顯示24月齡大鼠腎臟LC3表達(dá)顯著降低。③定量PCR結(jié)果顯示,在大鼠腎臟中,Atg7的表達(dá)隨增齡顯著降低。④Western blot結(jié)果顯示,泛素結(jié)合蛋白p62/SQSTM1和多聚泛素聚集體polyubiqintin aggregates隨增齡在24月齡大鼠腎臟組織中表達(dá)顯著升高。Beclin-1/Atg6隨增齡改變不明顯。組織蛋白酶B在24月齡組大鼠腎臟中

8、表達(dá)顯著降低。⑤免疫熒光和免疫組化結(jié)果顯示,在12月齡和24月齡大鼠腎臟中,DNA損傷產(chǎn)物8-OHdG的表達(dá)顯著高于3月齡大鼠。⑥透射電鏡觀察顯示:12月齡和24月齡大鼠的腎臟組織中,腎小管上皮細(xì)胞中線粒體出現(xiàn)腫脹變形和線粒體嵴結(jié)構(gòu)的紊亂。⑦腎組織PAS染色顯示:與3月齡相比,24月齡大鼠腎小球硬化明顯。腎小管間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),小管萎縮。進(jìn)一步探討了不同熱量飲食干預(yù)對(duì)腎臟自噬的功能影響。①與正常飲食組相比,高熱量飲食組大鼠腎臟中p16

9、表達(dá)顯著增加,熱量限制組顯著降低。②與正常飲食組大鼠腎臟組織相比,高熱量飲食組大鼠腎臟組織LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ顯著降低,熱量限制組大鼠腎組織LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ顯著增高。免疫熒光結(jié)果顯示熱量限制組大鼠腎臟組織LC3表達(dá)高于正常飲食組,高熱量飲食組LC3表達(dá)低于正常飲食組。③與正常飲食組大鼠腎臟相比,p62/SQSTM1和polyubiqintin aggregates在熱量限制組大鼠腎臟組織中表達(dá)顯著降低,而高熱量飲食組顯著升高。④

10、免疫熒光結(jié)果顯示,與正常飲食組相比,高熱量飲食組8-OHdG的表達(dá)升高,熱量限制組8-OHdG的表達(dá)降低。⑤氧化損傷標(biāo)志物羰基和丙二醛(MDA)的檢測(cè)顯示,高熱量飲食組顯著高于正常飲食組,熱量限制組顯著低于正常飲食組。⑥腎組織PAs染色顯示:與正常飲食組相比,高熱量飲食組腎小球系膜細(xì)胞增殖程度和腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)加重,熱量限制組腎小球系膜細(xì)胞增殖程度和腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。
　　 結(jié)論：在大鼠腎臟的自噬功能隨著增齡而下降,