帕金森病中miR-128作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：帕金森病( Parkinson’sdisease)是目前常見的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要特征表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體通路的損害。目前帕金森病的病因及發(fā)病機(jī)制還未完全研究清楚，目前也沒有發(fā)現(xiàn)能有效治療帕金森病的方法。眾多帕金森病的患者，給家庭和社會(huì)都帶來了非常沉重的負(fù)擔(dān)，也迫使我們不斷的突破目前的困境，不斷的發(fā)掘新的角度來研究帕金森病的病因及發(fā)病機(jī)制，不斷的尋找和嘗試新的治療思路。微小RNA（miRNAs）是一類短小的在真核生物內(nèi)源性表

2、達(dá)的非編碼單鏈RNA分子，長度約21-24個(gè)核苷酸，主要是通過促進(jìn)靶基因mRNA的翻譯或者降解來發(fā)揮調(diào)控作用。近年的研究已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究證實(shí)miR-128在帕金森病中也起著十分重要的作用，在小鼠體內(nèi)敲低miR-128表達(dá)，小鼠可能出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)，而過表達(dá)miR-128則可以緩解小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HDAC調(diào)控在PD的發(fā)病機(jī)制及治療中均有重要作用，且使用藥物或遺傳手

3、段調(diào)控HDAC（特別是HDAC1、HDAC4、HDAC6和HDAC10等亞型）可調(diào)節(jié)自噬活性。通過TargetScan、miRBase等數(shù)據(jù)庫分析miR-128可能的靶基因，我們找到HDAC4作為靶基因，并假設(shè)miR-128可以調(diào)控HDAC4發(fā)揮作用，參與帕金森病的發(fā)生。
　　方法：1、通過魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24小后，通過RT-PCR檢測miR-128的表達(dá)變化。2、分別轉(zhuǎn)染miR-128過表達(dá)、敲低及陰性對(duì)照質(zhì)粒至SH

4、-SY5Y細(xì)胞內(nèi)，通過RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi) miR-128的表達(dá)水平變化。3、從TargetScan、MiRBase、miRDB等數(shù)據(jù)庫里篩選miR-128的 targetgene。4、通過雙熒光素酶活性檢測實(shí)驗(yàn)明確miR-128與HDAC4之間是否有直接作用關(guān)系。5、在SH-SY5Y細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-128過表達(dá)、敲低及陰性對(duì)照質(zhì)粒，通過細(xì)胞免疫熒光觀察HDAC4在各組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化。6、在SH-SY5Y細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-

5、128過表達(dá)、敲低及陰性對(duì)照質(zhì)粒，利用RT-PCR和Western-blot檢測各組HDAC4和α‐synuclein的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、魚藤酮處理組的細(xì)胞內(nèi)miR-128的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低。2、miR-128調(diào)控HDAC4基因表達(dá)：通過熒光素酶活性檢測，證實(shí)了miR-128可以與HDAC4 mRNA3’UTR區(qū)結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-128可以抑制HDAC4的表達(dá)，敲低miR-128則使細(xì)胞內(nèi)HDAC4的表

6、達(dá)增加。3、細(xì)胞免疫熒光可見miR-128敲低組細(xì)胞內(nèi)HDAC4的表達(dá)增加，過表達(dá)組的HDAC4表達(dá)減少。4、Real-time PCR和Western-blot檢測顯示未給予魚藤酮處理和給予魚藤酮處理的細(xì)胞組中，過表達(dá)miR-128都可以降低HDAC4和α‐synuclein的表達(dá)，而敲低miR-128的表達(dá)可以使HDAC4和α‐synuclein的表達(dá)增加。
　　結(jié)論：1、本研究發(fā)現(xiàn)，miR-128可以通過與HDAC43’UT

7、R結(jié)合抑制HDAC4的蛋白表達(dá)。2、利用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，對(duì)miR-128在帕金森細(xì)胞模型中的作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)miR-128的細(xì)胞內(nèi)HDAC4和α‐synuclein的表達(dá)減少，而敲低miR-128的細(xì)胞內(nèi)HDAC4和α‐synuclein的表達(dá)增加。因此，我們猜測，過表達(dá)的miR-128可以下調(diào)HDAC4的水平，從而減少α‐synuclein的過表達(dá)及病理性聚集，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為帕金森病提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。