GR通過DEC1影響神經(jīng)細胞分化及其自身調(diào)節(jié)機制在ADHD大鼠中的研究.pdf

1、目的：比較WKY和SHR大鼠前額皮質(zhì)區(qū)(Prefrontal Cortex，PFC)以及PC12H和PC12L細胞中GR和DEC1的蛋白表達差異。檢測GR和DEC1對PC12細胞分化的調(diào)控。研究GR通過調(diào)節(jié)DEC1在ADHD中的作用機制。探討GR受調(diào)節(jié)機制。
　　方法：
　　1.通過Western blot驗證WKY和SHR大鼠PFC區(qū)的GR、DEC1蛋白表達差異。
　　2.通過Western blot驗證PC12H、

2、PC12L細胞的GR、DEC1蛋白表達差異。
　　3.構建GR過表達質(zhì)粒、GR干擾質(zhì)粒，通過Western blot驗證已構建質(zhì)粒的有效性，分別瞬時轉(zhuǎn)染PC12H、PC12L細胞，觀察、記錄并分析PC12細胞形態(tài)的變化。
　　4.通過免疫共沉淀法驗證WKY和SHR大鼠腦組織中GR和DEC1的相關性。
　　5.通過Western blot驗證已構建質(zhì)粒的有效性。DEC1過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染PC12H細胞，siDEC1處理P

3、C12L細胞，觀察、記錄并分析PC12細胞形態(tài)的變化。
　　6.通過免疫共沉淀法檢測GR在SHR和WKY大鼠PFC磷酸化水平的表達差異。
　　7.通過數(shù)據(jù)庫工具NetPhos2.0 Server及網(wǎng)站PhosphoSitePlus預測GR的潛在酪氨酸磷酸化位點。
　　結果：
　　1.GR和DEC1在SHR大鼠PFC區(qū)的蛋白表達均比WKY大鼠升高。
　　2.GR在PC12H細胞相對低表達，而PC12L細胞相對

4、高表達，DEC1在兩種不同分化程度的細胞上的表達差異與GR有相同趨勢。
　　3.在PC12L、PC12H細胞中瞬時轉(zhuǎn)染GR干擾質(zhì)粒及GR過表達質(zhì)粒，其蛋白水平出現(xiàn)明顯下降或升高，且GR干擾后的第2天起，PC12L細胞出現(xiàn)神經(jīng)突增生，表現(xiàn)為神經(jīng)突長度增加及含有3個及三個以上神經(jīng)突的細胞百分比的增加，且隨時間變化神經(jīng)突長度呈遞增趨勢。已驗證有效性的GR過表達質(zhì)粒在PC12H細胞轉(zhuǎn)染后使細胞神經(jīng)突生長受到抑制，其形態(tài)變化與GR干擾后的P

5、C12L細胞呈相反趨勢。
　　4.將腦組織裂解液用GR抗體免疫沉淀后的復合物中，DEC1蛋白也能表達，同時，用DEC1抗體免疫沉淀腦組織裂解液，發(fā)現(xiàn)GR蛋白也能表達。
　　5.在PC12L、PC12H細胞中用siDEC1處理或瞬時轉(zhuǎn)染DEC1過表達質(zhì)粒，其蛋白水平出現(xiàn)明顯下降或升高，且PC12L細胞經(jīng)DEC1干擾后出現(xiàn)神經(jīng)突增生，表現(xiàn)為神經(jīng)突長度從第2天開始明顯伸長，但含有3個及以上神經(jīng)突的細胞所占比例是從第4天開始出現(xiàn)明顯

6、增加，且均隨時間變化呈遞增趨勢;已驗證有效性的DEC1過表達質(zhì)粒在PC12H細胞轉(zhuǎn)染后使細胞神經(jīng)突生長受到抑制，其形態(tài)變化與GR干擾后的PC12L細胞呈相反趨勢。
　　6.在免疫熒光圖中可見DEC1過表達的PC12H細胞中神經(jīng)突標志物——Tau、GAP-43和MAP-2的熒光值較空白對照組升高。
　　7.SHR大鼠的PFC區(qū)中GR的磷酸化水平較WKY大鼠升高，特別是酪氨酸磷酸化水平，DEC1的酪氨酸磷酸化水平無明顯差異，但其

7、在SHR大鼠PFC中絲氨酸磷酸化水平較WKY大鼠升高。
　　8.GR第226位絲氨酸磷酸化水平在SHR和WKY大鼠大PFC無明顯差異，而GR第211位絲氨酸磷酸化水平在SHR大鼠表達較高。
　　9.GR潛在的酪氨酸磷酸化位點可能有Y31、Y109、Y124、Y321、Y353等。
　　結論：
　　1.GR和DEC1在ADHD大鼠前額區(qū)表達水平升高。
　　2.GR和DEC1均能抑制PC12細胞分化，并且有時間