缺氧條件下肝癌細(xì)胞中基因DEC1、HIF-1α、PCNA、Survivin差異表達(dá)的研究及其意義.pdf

1、癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約有800萬(wàn)人死于癌癥。目前我國(guó)腫瘤防控面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，惡性腫瘤已成為居民最大的健康殺手，腫瘤發(fā)病率明顯增高。每年新發(fā)癌癥人數(shù)280萬(wàn)，死于癌癥人數(shù)190萬(wàn)。而肝癌死亡率在全國(guó)惡性腫瘤死亡率中排在第二位。雖然目前對(duì)于肝癌的治療方案已經(jīng)日趨完善，但是往往治療效果較差，目前肝癌的發(fā)生發(fā)展及其侵襲機(jī)制仍未明確，對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究一直是生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)

2、問(wèn)題。因此對(duì)于肝癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面的研究，并從中尋找具有針對(duì)性靶向性的干預(yù)位點(diǎn)，從而進(jìn)行定向靶位治療的方法探索是臨床研究的一大挑戰(zhàn)。
　　 分化型胚胎軟骨發(fā)育基因1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)在1997年首次發(fā)現(xiàn)于人類(lèi)胚胎軟骨組織中。DEC1蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家

3、族，在細(xì)胞的增殖與分化、淋巴細(xì)胞的成熟、調(diào)節(jié)分子時(shí)鐘節(jié)律、脂類(lèi)代謝、細(xì)胞的凋亡、缺氧反應(yīng)、免疫耐受以及腫瘤形成等機(jī)體生理功能中發(fā)揮重要作用。DEC1蛋白廣泛表達(dá)于人類(lèi)大多數(shù)正常組織以及多種腫瘤組織中，如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌，但是在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)以及缺氧條件下的表達(dá)情況仍未明了.
　　 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)DEC1的表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia induce factor-1α，HIF-1α)有密切聯(lián)系

4、，在對(duì)乳腺癌、肺腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌膀胱癌、胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧可以誘導(dǎo)DEC1的高表達(dá)，DEC1與HIF-1α的表達(dá)具有顯著相關(guān)性。而在肝癌細(xì)胞系中DEC1與HIF-1α的表達(dá)情況仍無(wú)研究。
　　 增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是一種僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細(xì)胞核內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)，其量的變化與DNA合成一致，具有一定的周期性，檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖

5、狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。Survivin為凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein，IAP)家族一員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。我們通過(guò)選取PCNA與Survivin作為反應(yīng)細(xì)胞增殖凋亡指標(biāo)，來(lái)初步探討DEC1在缺氧條件下對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞系Bei-7402、

6、HepG2及正常人肝細(xì)胞系QSG-7701為研究對(duì)象，探討正常氧條件及模擬缺氧條件下基因DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin在肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)情況，初步探討DEC1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：
　　 1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2及正常人肝細(xì)胞系QSG-7701中DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin基因mRNA在正常及缺氧

7、條件下的表達(dá)情況。
　　 2.應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色的方法檢測(cè)正常及缺氧24 h條件下肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2中DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin蛋白的表達(dá)定位。
　　 3.以正常人肝細(xì)胞系QSG-7701為對(duì)照，采用Western Blot方法比較DEC1蛋白在正常人肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。檢測(cè)缺氧條件下肝癌細(xì)胞中DEC1、HIF-1α、PCNA、Survivin蛋白水平的表達(dá)。

8、r>　　 結(jié)果：
　　 1.在正常氧含量條件下，肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2細(xì)胞中DEC1、HIF-1α、PCAN、Survivin基因的mRNA的表達(dá)量明顯高于正常人肝細(xì)胞系QSG-7701。
　　 2.缺氧條件下，肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2和正常人肝細(xì)胞系QSG-7701中DEC1基因mRNA顯著高表達(dá)。肝癌細(xì)胞系Bel-7402、正常人肝細(xì)胞系QSG-7701中HIF-1α基因mRNA的表達(dá)

9、沒(méi)有顯著性差異;肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中HIF-1α基因mRNA的表達(dá)除6h組沒(méi)有顯著性差異外，3h、12h和24 h均顯著高于0h正常對(duì)照組。
　　 3.正常人肝細(xì)胞系QSG-7701中PCNA基因mRNA的表達(dá)變化沒(méi)有顯著性差異;肝癌細(xì)胞系Bel-7402中PCNA基因mRNA表達(dá)除缺氧24 h組有顯著性差異外，其他各組均無(wú)顯著性差異;而肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中PCNA基因mRNA的表達(dá)除了3h組外，6h、12h、24

10、h組均顯著性增高。肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2以及正常人肝細(xì)胞系QSG-7701中，Survivin基因的mRNA的表達(dá)在缺氧培養(yǎng)調(diào)件下沒(méi)有顯著性差異。
　　 4.細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示，棕黃色顆粒為陽(yáng)性顆粒，肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2中DEC1、HIF-1α蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都有表達(dá)，而PCNA、Survivin蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中。
　　 5.在正常氧含量條件下，肝癌細(xì)胞系Bel-7402、

11、HepG2細(xì)胞中DEC1蛋白的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞系QSG-7701。在缺氧培養(yǎng)條件下，肝癌細(xì)胞系Bel-7402中DEC1、HIF-1α、PCNA蛋白缺氧組的表達(dá)顯著高于0h正常對(duì)照組，Survivin蛋白在缺氧12h后其表達(dá)量顯著性增高。肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中HIF-1α、PCNA蛋白缺氧組的表達(dá)顯著高于0h正常對(duì)照組，DEC1、Survivin蛋白在3h、6h、24 h組表達(dá)量顯著高于0 h正常對(duì)照組，而12h組與0h組比