銀屑病皮損及缺氧條件下HaCaT細(xì)胞HIF-1α與血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其組織病理學(xué)改變以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、新生血管形成、炎癥細(xì)胞浸潤為基本特征。目前認(rèn)為銀屑病組織病理學(xué)改變的三大基本特征之間的關(guān)系密不可分，其中新生血管形成可能啟動(dòng)了整個(gè)病理變化過程。目前對(duì)銀屑病的血管生成機(jī)制的研究已成為熱點(diǎn)，特別是一些血管生成相關(guān)因子日益受到重視。角質(zhì)形成細(xì)胞是促血管生成因子的主要來源之一，可分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor

2、，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfacto-α，TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)、內(nèi)皮細(xì)胞促血管生成因子、胸苷磷酸化酶和白介素-8(interleukin-8，IL-

3、8)等。其中VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)、最專一的直接促進(jìn)血管生成的因子之一；iNOS則通過誘導(dǎo)生成NO，發(fā)揮促進(jìn)血管生成等作用。
　　 微血管是皮膚組織與循環(huán)血液進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，當(dāng)組織增生或其他因素超過了血管供應(yīng)能力時(shí)，就將導(dǎo)致組織缺氧，這時(shí)機(jī)體感受O2濃度變化并對(duì)缺氧做出適應(yīng)性反應(yīng)，用以維持組織氧供并增強(qiáng)細(xì)胞在缺氧情況下的適應(yīng)能力，其中最重要的低氧信號(hào)傳遞因子就是低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible fa

4、ctor1，HIF-1)，HIF-1是低氧時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)核心調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下，細(xì)胞產(chǎn)生的HIF-1與靶基因中的低氧反應(yīng)元件(hypoxia responseelemet，HRE)結(jié)合并促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起一系列細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)，對(duì)保持機(jī)體的氧穩(wěn)態(tài)，具有重要的病理生理學(xué)意義。
　　 最新的一些研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可能參與銀屑病的發(fā)生與發(fā)展。HIF-1α是調(diào)節(jié)HIF-1活性的功能亞單位，在缺氧條件下，它

5、穩(wěn)定存在并誘導(dǎo)如VEGF和iNOS等靶基因的表達(dá)。因此，我們推測(cè)在銀屑病中是否存在缺氧誘導(dǎo)了HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控一些與血管生成相關(guān)靶基因如：VEGF和iNOS的表達(dá)并參與銀屑病的新生血管形成，從而在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程起著重要作用。我們擬通過三個(gè)部分的研究來證實(shí)：1.銀屑病皮損中HIF-1α與血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系；2.低氧培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞中HIF-1α與血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系；3.抑制HIF-1α的表達(dá)對(duì)低氧條件下

6、培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。通過這些研究試圖揭示HIF-1α在銀屑病的新生血管形成機(jī)制中的作用，并為銀屑病的治療尋找有效的新途徑提供理論依據(jù)。
　　 第一部分、銀屑病皮損中HIF-1α與血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　 目的：探討HIF-1α、VEGF、iNOS在進(jìn)行期尋常型銀屑病皮損及非皮損中的表達(dá)，并分析它們的相關(guān)性，同時(shí)分析其與銀屑病血管增生的相關(guān)性。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)SABC法和

7、蛋白印跡法檢測(cè)32例進(jìn)行期尋常型銀屑病患者皮損組織、非皮損組織和20例正常人皮膚組織中HIF-1α、VEGF和iNOS的蛋白表達(dá)水平，并采用圖像分析技術(shù)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定量分析，同時(shí)用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算皮膚組織中的微血管密度(MVO)。
　　 結(jié)果：銀屑病患者皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表達(dá)的平均積分吸光度值分別為86.96±2.56、95.81±2.74、90.01±2.77，MVD為33.80±4.

8、15；非皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表達(dá)的平均積分吸光度值分別為30.14±7.77、44.32±9.06、48.76±10.08，MVD為17.16±3.54；正常人皮膚組織中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表達(dá)的平均積分吸光度值分別為29.15±7.08、34.±13.82、37.33±3.13，MVD為18.48±3.67。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，銀屑病患者組皮損組織中三者的表達(dá)與MVD均高于非皮損組織和正常人皮膚組織

9、(P<0.01)，而銀屑病患者非皮損組織與正常人皮膚組織相比，差異無顯著性(P>0.05)。銀屑病患者組皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表達(dá)均與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.947，P<0.01；r=0.859，P<0.01；r=0.899，P<0.01)；銀屑病患者組皮損組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)與VEGF及iNOS蛋白的表達(dá)亦呈明顯正相關(guān)(r=0.817，P<0.01；r=0.873，P<0.01)；蛋白印跡法檢

10、測(cè)銀屑病患者組皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表達(dá)的平均值分別為0.76±0.068、1.21±0.131、0.96±0.045，非皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表達(dá)的平均值分別為0.42±0.081、0.78±0.062、0.44±0.046，20例正常對(duì)照者皮膚組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表達(dá)的平均值分別為0.32±0.093、0.73±0.098、0.43±0.098。上述結(jié)

11、果顯示銀屑病患者皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組(P均<0.01)，而非皮損組織中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：進(jìn)行期尋常型銀屑病皮損組織中存在HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白的過表達(dá)，三者在促進(jìn)銀屑病新生血管生成中具有協(xié)同作用，可能在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作

12、用。
　　 第二部分、缺氧條件下HaCaT細(xì)胞HIF-1α與血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的研究
　　 目的：研究缺氧條件下角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 方法：分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，培養(yǎng)4、8、12、24h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)及Western blot技術(shù)

13、檢測(cè)各組HaCaT細(xì)胞中HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：低氧條件下與常氧條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞的HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但HIF-1α蛋白表達(dá)水平在低氧條件下較常氧條件下有顯著增高(P<0.01)。低氧條件下與常氧條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞的VEGF、iNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平比較均顯著增高(P<0.01)。
　　 結(jié)論：1)低氧對(duì)HaC

14、aT細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)調(diào)控?zé)o明顯作用，但使HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。2)低氧對(duì)HaCaT細(xì)胞的VEGF及iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　 第三部分、HIF-1α小干擾RNA對(duì)HaCaT細(xì)胞血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 目的：探討HIF-1α-siRNA對(duì)低氧條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞的HIF-1α、VEGF和iNOSmRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 方法設(shè)計(jì)并合成針對(duì)H

15、IF-1α的特異性小干擾RNA，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染對(duì)照組，分別在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)24h后，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，采用real time RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)HIF-1α、VEGF和iNOSmRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的HaCaT細(xì)胞低氧培養(yǎng)24h后，HIF-1α、VEGF和iN