胃癌分化程度與神經(jīng)分布相關(guān)性及胃癌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞相互作用的研究.pdf

1、胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，胃癌死亡率居惡性腫瘤死亡率的第二位。在我國，胃癌的死亡率曾長期位居各惡性腫瘤之首。因此，胃癌的生物學(xué)特性及治療方法一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，特別是腫瘤組織中淋巴管與血管的研究，頗受關(guān)注，已經(jīng)取得了較為公認(rèn)的結(jié)果，但關(guān)于腫瘤內(nèi)神經(jīng)的研究卻很少得到關(guān)注。在很長一段時(shí)間內(nèi)，醫(yī)學(xué)界曾認(rèn)為腫瘤組織內(nèi)不存在神經(jīng)支配，然而，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高，不斷有學(xué)者報(bào)道在腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維的存在。

2、有研究發(fā)現(xiàn)其不同于正常組織內(nèi)的神經(jīng)纖維，并分散走行于胃癌細(xì)胞之間，因而推測腫瘤內(nèi)神經(jīng)纖維的存在不僅僅是腫瘤在生長過程中包裹原有胃壁組織中神經(jīng)纖維的結(jié)果，很有可能存在新生的神經(jīng)纖維。電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維通過膨體與癌細(xì)胞直接接觸。在我實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在胃癌組織內(nèi)可見大量P-ERK1/2免疫陽性反應(yīng)的神經(jīng)纖維，呈束狀或串珠狀走行，并可見呈巢狀分布的P-ERK1/2免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞。神經(jīng)纖維主要分布在P-ERK1/2免疫陽性細(xì)胞

3、的四周并與這些細(xì)胞相毗鄰。在胃癌組織有大量表達(dá)神經(jīng)生長因子(NGF)的細(xì)胞，體外培養(yǎng)的低分化胃癌細(xì)胞系(MNK45)高表達(dá)神經(jīng)生長因子(NGF)。然而，在腫瘤組織這樣一個(gè)特殊的微環(huán)境下，神經(jīng)發(fā)揮了怎樣的作用，腫瘤對(duì)神經(jīng)的生物學(xué)行為構(gòu)成了怎樣的影響，其相互作用與腫瘤的分化程度，腫瘤的轉(zhuǎn)移，與患者的年齡、性別、預(yù)后是否具有相關(guān)性等問題尚缺乏相關(guān)的研究。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討腫瘤分化程度與腫瘤組織中神經(jīng)分布的相關(guān)性，

4、并從細(xì)胞水平探討腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用與影響。
　　一、正常胃組織與胃癌組織內(nèi)神經(jīng)分布密度的比較
　　目的：比較正常胃組織與胃癌組織內(nèi)神經(jīng)分布密度及神經(jīng)形態(tài)的差異。方法：取66例胃癌患者活體手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本及正常組織標(biāo)本，對(duì)每位患者的正常組織和癌組織切片進(jìn)行比較。用GAP-43對(duì)神經(jīng)纖維進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下觀察胃癌組織和正常胃組織內(nèi)神經(jīng)纖維的密度及形態(tài)差異。Image-proplus6.0圖像分析系統(tǒng)在

5、相同的系統(tǒng)條件下進(jìn)行GAP-43免疫陽性神經(jīng)纖維分布密度的分析。運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：在正常胃組織內(nèi)可見大量GAP-43免疫染色陽性的神經(jīng)纖維，在黏膜層中，神經(jīng)纖維走行于胃黏膜腺體之間，與黏膜下的毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管相伴行，在黏膜下層中，神經(jīng)纖維分布于環(huán)行肌層和粘膜之間，神經(jīng)纖維交匯融合成神經(jīng)纖維網(wǎng)，并可見神經(jīng)纖維束，神經(jīng)纖維在肌層中散在分布于外縱行肌層和內(nèi)環(huán)行肌叢，其分布密度較高，為22854

6、±4024。胃癌組織中亦存在GAP-43免疫染色陽性的神經(jīng)纖維，但神經(jīng)纖維的分布范圍局限于胃癌組織的邊緣和被胃癌浸潤的胃組織內(nèi)，纖維密度明顯低于正常胃組織，其形態(tài)和神經(jīng)走行均失去正常胃組織內(nèi)所具有的形態(tài)和走形，其分布密度較低，為12586±892，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在檢測的66例患者標(biāo)本中，所有癌組織內(nèi)均有神經(jīng)纖維分布，陽性率達(dá)100％，且所有患者癌組織中的神經(jīng)纖維密度均低于正常組織。結(jié)論：胃癌組織內(nèi)存在神經(jīng)纖維的分

7、布，其形態(tài)、走行與正常胃組織中的神經(jīng)纖維有所不同，分布密度明顯低于正常胃組織。
　　二、高分化與低分化胃癌組織中神經(jīng)纖維分布密度的比較
　　目的：比較不同分化程度的胃癌組織中神經(jīng)纖維分布密度的差異，尋找胃癌分化程度與胃癌組織中神經(jīng)纖維分布密度的相關(guān)性。方法：分別在28例高分化與38例低分化胃癌患者的活體手術(shù)切除標(biāo)本的癌組織中心位置取材，進(jìn)行GAP-43免疫染色，顯微鏡下觀察高分化與低分化胃癌組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度的差異，及神

8、經(jīng)纖維的形態(tài)及走行。Image-proplus6.0圖像分析系統(tǒng)在相同的系統(tǒng)條件下進(jìn)行GAP-43免疫陽性神經(jīng)纖維分布密度的分析。運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：低分化胃癌組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度為17024±857，高分化胃癌組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度為10323±912。其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)中未見不同分化程度的胃癌組織中神經(jīng)纖維的形態(tài)及走行具有明顯差異。結(jié)論：低分化胃癌組織內(nèi)神經(jīng)纖維

9、分布密度高于高分化胃癌組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度，其形態(tài)、走行未見明顯差異。
　　三、高分化與低分化胃癌患者正常胃組織中神經(jīng)纖維分布密度的比較
　　目的：比較不同分化程度的胃癌患者正常胃壁組織中神經(jīng)纖維分布密度的差異。方法：分別取28例高分化與38例低分化胃癌患者活體手術(shù)切除標(biāo)本距癌組織5cm以遠(yuǎn)處正常胃壁組織，進(jìn)行GAP-43免疫染色，顯微鏡下觀察其神經(jīng)纖維分布密度及形態(tài)、走行。Image-proplus6.0圖像分析系統(tǒng)在相

10、同的系統(tǒng)條件下進(jìn)行GAP-43免疫陽性神經(jīng)纖維分布密度的分析。運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：高分化胃癌患者正常胃壁組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度為23862±4895，低分化胃癌患者正常胃壁組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度為20237±3794。其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：胃癌患者正常胃壁組織內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度與胃癌的分化程度無關(guān)。
　　四、MKN28/MKN45細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

11、
　　目的：研究MKN28（高分化胃癌細(xì)胞系）/MKN45（低分化胃癌細(xì)胞系）對(duì)PC12（腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系）增殖的影響，并比較其差異。方法：將復(fù)蘇后的第三代MKN28/MKN45進(jìn)行梯度降血清培養(yǎng)，并在低血清條件下培養(yǎng)12h后，加入維生素C，促進(jìn)其分泌。每4h換液一次，分別收集其上清液，并用于培養(yǎng)PC12細(xì)胞。共分三組對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)：MKN28組，MKN45組和普通培養(yǎng)液組。MTT法分別檢測PC12細(xì)胞在1，3，5，

12、7d的細(xì)胞增殖狀況。運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：MKN28組與MKN45組PC12細(xì)胞增殖率在第3、第5天均高于普通培養(yǎng)液組，MKN45組PC12細(xì)胞增殖率在第3、第5天高于MKN28組。結(jié)論：MKN28與MKN45胃癌細(xì)胞均能促進(jìn)PC12細(xì)胞系的增殖。相比之下，MKN45具有更強(qiáng)的促進(jìn)增殖能力。
　　五、PC12細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)MKN28/MKN45細(xì)胞增殖的影響
　　目的：研究PC12

13、對(duì)MKN28/MKN45增殖的影響。方法：將復(fù)蘇后的第三代PC12細(xì)胞進(jìn)行梯度降血清培養(yǎng)，并在低血清條件下培養(yǎng)12h后，加入維生素C，促進(jìn)其分泌。每4h換液一次，收集其上清液，并用于培養(yǎng)MKN28/MKN45細(xì)胞。分別采用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)作為各自的對(duì)照組。MTT法分別檢測MKN28/MKN45細(xì)胞在第1，3，5，7d的細(xì)胞增殖狀況。運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：PC12對(duì)MKN28增殖的影響：在第3、第5

14、、第7d條件培養(yǎng)液組MKN28的細(xì)胞增殖率均高于普通培養(yǎng)液組。PC12對(duì)MKN45增殖的影響：在第3、5d條件培養(yǎng)液組MKN45的細(xì)胞增殖率均高于普通培養(yǎng)液組。結(jié)論：PC12細(xì)胞對(duì)高、低分化胃癌細(xì)胞均具有促進(jìn)增殖的作用。
　　六、PC12-MKN28/PC12-MKN45混合細(xì)胞團(tuán)裸鼠體內(nèi)移植檢測癌細(xì)胞對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響
　　目的：研究MKN28/MKN45在體內(nèi)對(duì)PC12增殖的影響。方法：PKH26熒光標(biāo)記PC12細(xì)胞，

15、分別與MKN28、MKN45均勻混合，用膠原明膠制備PC12-MKN28細(xì)胞團(tuán)與PC12-MKN45細(xì)胞團(tuán)。每種細(xì)胞團(tuán)內(nèi)PC12細(xì)胞數(shù)量均為1×106個(gè)，MKN28/MKN45為1×107個(gè)。取10只裸鼠，將細(xì)胞團(tuán)移植于裸鼠雙側(cè)下腹壁皮下組織內(nèi)，6w取材，觀察細(xì)胞團(tuán)大小，重量。HE染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞團(tuán)中PC12細(xì)胞增殖狀況。結(jié)果：PC12-MKN45細(xì)胞團(tuán)體積普遍大于PC12-MKN28細(xì)胞團(tuán)。熒光顯微鏡下觀察，P