成肌細(xì)胞介導(dǎo)的hIGF-1基因轉(zhuǎn)移促小鼠脛骨骨折愈合作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨折愈合,減少骨不連及骨延遲愈合發(fā)生率一直是創(chuàng)傷骨科面臨的重要課題。背景:據(jù)統(tǒng)計(jì),骨折病人中大約有5％-10%會(huì)出現(xiàn)延遲愈合或骨不愈合。如何促進(jìn)目前在骨不連的治療上自體骨移植是促進(jìn)骨愈合的金標(biāo)準(zhǔn),但自體骨移植也存在不少的并發(fā)癥,例如:多手術(shù)部位及切口引起的肢體承重狀態(tài)和功能的下降、失血增多、手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)、發(fā)生骨折及感染風(fēng)險(xiǎn)增加和疼痛。況且,自體骨移植也并不能保證一定會(huì)使骨折愈合。這些都使我們有必要從分子和細(xì)胞水平上對(duì)骨形成進(jìn)行更深入的了

2、解,以便找到更好的方法促進(jìn)骨愈合。
　　BMPs、TGF-β、IGFs、FGFs等)已經(jīng)被鑒別并證實(shí)在間充質(zhì)細(xì)。創(chuàng)傷病人大多骨折的同時(shí)會(huì)伴有肌肉損成骨細(xì)胞成骨還可以促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化與增殖,提高損傷肌肉的愈合質(zhì)量。但由于胰島素樣生長(zhǎng)因子-1代謝半衰期短,直接注射需要因子作用濃度高,且需多次反復(fù)注射,價(jià)格昂貴,可行性不高;利用載體直接緩釋IGF-1,存在著隨時(shí)間的延長(zhǎng)釋放量下降,很難維持有效劑量。隨著基因治療的研究發(fā)展,將轉(zhuǎn)有胰島素

3、樣生長(zhǎng)因子-1基因的細(xì)胞移植入損傷區(qū),達(dá)到該基因在體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)已可行,并可解決以上難題?，F(xiàn)多種生長(zhǎng)因子(例如:胞分化成骨原細(xì)胞和骨形成中起著重要的作用傷,在眾多的生長(zhǎng)因子中,胰島素樣生長(zhǎng)因子-1除了能直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞、外,
　　目的:觀察攜帶外源人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1)基因的成肌細(xì)胞體內(nèi)局部多點(diǎn)注射對(duì)C57BL/6J小鼠脛骨骨折愈合的影響,為利用

4、轉(zhuǎn)hIGF-1基因的成肌細(xì)胞治療骨折提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法:8周齡雄性C57BL/6J小鼠42只,體重22~25g,用2%戊巴比妥鈉,30mg/kg,行腹腔內(nèi)注射麻醉后,以定點(diǎn)手法折骨術(shù)建立左脛骨中段閉合骨折的動(dòng)物模型,隨機(jī)分成兩組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。分別在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨折周圍肌肉組織中多點(diǎn)注射0.3ml轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞懸液(約含3×106個(gè)BrdU標(biāo)記的成肌細(xì)胞)或等量生理鹽水,術(shù)后于第2、3、4周每組各處死7只,骨

5、痂行HE染色,觀察形成骨痂面積的大小和組成成分的變化。術(shù)后第2、4骨折的自然愈合過(guò)程一般分為五個(gè)階段,包括:對(duì)損傷的速發(fā)性反應(yīng)、膜內(nèi)骨形成、軟骨形成、軟骨內(nèi)骨化和骨的重塑。在骨折愈合過(guò)程中大量的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及它們的受體在骨折處周圍呈現(xiàn)較高水平,這些蛋白中有些在骨組織中表達(dá),有些則由損傷周圍的炎性細(xì)胞釋放,所以有理由相信它們?cè)诠钦鄣挠线^(guò)程中起著重要的作用。
　　周曾注射轉(zhuǎn)hIGF-1基因成肌細(xì)胞和生理鹽水的肌肉行BrdU和

6、hIGF-1免疫組織化學(xué)染色分析外源性細(xì)胞在體內(nèi)有無(wú)存活并表達(dá)hIGF-1,并用HMIAS-2000高清析度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對(duì)IGF-1蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè),其結(jié)果以平均灰度值表示,平均灰度值低示表達(dá)水平高;左脛骨行X線攝片以觀察骨折愈合情況;骨痂采用透射電鏡觀察生長(zhǎng)情況。
　　占骨痂總面積的百分比均高于對(duì)照組,其中第3、4周經(jīng)F結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞BrdU和hIGF-1免疫組化染色均陽(yáng)性,各對(duì)照組BrdU和hIGF

7、-1免疫組化染色均陰性,4周實(shí)驗(yàn)組平均灰度值雖稍高于2周實(shí)驗(yàn)組,但經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P>0.05,差異無(wú)顯著性;所有實(shí)驗(yàn)組外骨痂中小梁骨檢驗(yàn)兩組的差異具有顯著性(P<0.05);X線顯示第4周實(shí)驗(yàn)組有較多骨痂形成,經(jīng)秩和檢驗(yàn)與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05);電鏡顯示實(shí)驗(yàn)組骨生成細(xì)胞的數(shù)量、活躍程度和膠原纖維的數(shù)量、分布均優(yōu)于對(duì)照組。
　　結(jié)論:1、攜hIGF-1基因的成肌細(xì)胞移植入C57BL/6J小鼠脛骨骨折處周圍肌肉中可存活4周