EGF納米微粒促糖尿病大鼠潰瘍愈合作用的實驗研究.pdf

1、目的：制備表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)納米微粒并對其微粒形貌、粒徑、載藥率、包封率和釋放情況進行評價；進行EGF納米微粒的體外細胞研究，應用小鼠成纖維細胞L929細胞系，采用MTT法進行EGF納米微粒的體外細胞實驗，檢測和評價EGF納米微粒生物學活性，研究微粒載體的毒性。采用EGF納米微粒治療DM大鼠潰瘍，比較EGF納米微粒和EGF兩種不同劑型對糖尿病(diabetes mellitus，DM)

2、大鼠潰瘍作用的差異，探討EGF納米微粒促愈合作用的機制。 方法： 1．利用改進的復乳法，以聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)作為載體，制備EGF納米微粒。 2．透射電子顯微鏡(transmissionelectron microscope，TEM)對EGF納米微粒形貌表征。 3．激光粒度儀/zeta電位儀分析微粒粒徑分布。 4．應用酶聯(lián)免疫吸附法

3、(enzyme linked immunosorbentassay，ELIsA)測定EGF納米微粒載藥率、包封率和釋藥行為。 5．L929細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，控制細胞濃度在1.0×10<'5>/ml，接種于細胞培養(yǎng)板上。 6．以含有1μg/L，5μg/L，10μg/L，50μg/L，100μg/L濃度的EGF納米微粒懸液加入細胞培養(yǎng)板中，同時設立對照，培養(yǎng)24小時，用噻唑藍(Thiazolylblue，MTT)法測定49

4、0nm處的0D值，研究不同濃度EGF納米微粒對細胞增殖能力的影響。 7．以10μg/L濃度的EGF納米微粒，EGF原液，空微粒加入細胞培養(yǎng)板中，同時設立空白對照。培養(yǎng)24小時，用MTT法測定490nm處的0D值，研究相同濃度不同劑型EGF對細胞增殖的影響。 8．以含有0.01μg/L，0.1 μg/L，1μg/L，10μg/L，100μg/L,EGF濃度相對應的納米空微粒為梯度，同時設立空白對照，培養(yǎng)24小時，用MTT、

5、法測定490nm處的0D值，研究空微粒對細胞是否存在毒性，是否影響細胞增殖。 9．尾靜脈注射STZ法制備DM大鼠模型。 10．用打孔器制備DM大鼠潰瘍模型。 11．DM潰瘍大鼠分為4組：分別為EGF納米微粒組(A組)，EGF原液組(B組)，空白微粒組(c組)，PBS溶媒對照組(D組)，每天給藥一次。 12．分別于3、7、14、21天照相，計算創(chuàng)面愈合率。 13．分別于3、7、14、21天取材，送病

6、理做HE切片和免疫組化(表皮生長因子受體，epidermalgrowth factor receptor EGFR，增殖核細胞抗原，proliferating cell nuclearantigen，PCNA)。 14.于14天取材，做電鏡觀察。 結果： 1．EGF納米微粒粒徑大小為150nm，粒徑分布比較均一，微粒之間無粘連，分散性好。載藥率為0.02％，包封率為85％。釋藥符合釋放動力學模型，微粒在快速滲透階

7、段快速釋放EGF使其達到藥物有效濃度，隨后在中速滲透階段和聚合物降解過程中在有效藥物濃度范圍內緩慢釋放EGF，釋放長達24小時。 2．不同濃度EGF納米微粒均促進細胞增殖，其中10μg/L為最適濃度(與對照組比，P<0.01)。 3．10μg/L濃度不同劑型EGF對細胞增殖的影響，四組間存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)，EGF納米微粒組與EGF原液組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，兩組與空白對照和空微粒組相比均有統(tǒng)計學意

8、義(P<0.01)，空白對照組和空微粒組相比沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 4．不同濃度空微粒對細胞沒有毒性，不影響細胞增殖(組間沒有差異，P>0.05)。 5．成功制備DM大鼠模型，一次成模率80.7％，二次追加全部成模。 6．愈合率顯示：在14天開始，A組與B組有差別(P<0.05)。 7．EGFR顯示：在7天以后，A組與B組有顯著差異(P<0.01)。PCNA顯示：在14天，A組與B組有顯著差異(

9、P<0.01)。 8．電鏡結果顯示：A組成纖維細胞中內質網(wǎng)數(shù)量最多，內質網(wǎng)擴張，內含大量膠原蛋白，其他各組成纖維細胞中內質網(wǎng)數(shù)量少，膠原顆粒少。 結論：成功制備EGF納米微粒。細胞實驗證明EGF納米微粒制備過程中EGF保持原有活性，EGF納米微粒與EGF原液比較，EGF納米微粒促進L929細胞增殖能力更強，微粒載體對細胞沒有毒性作用。EGF納米微粒與EGF原液比較，在治療DM大鼠潰瘍中，促進潰瘍愈合更快，更適用于臨床的應