生膚油防治糖尿病大鼠足潰瘍的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病引起的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)住院人數(shù)占糖尿病住院總?cè)藬?shù)的12.4％，每年的截肢患者中約50%發(fā)生于糖尿病足潰瘍患者，是非外傷性致殘的主要原因[1,2]。西醫(yī)常采用內(nèi)服降血糖藥物或外科手術(shù)改善足潰瘍，存在副作用大，手術(shù)費(fèi)用昂貴等問題；傳統(tǒng)中醫(yī)多采用辯證論治的外治法對(duì)癥治療，收效甚佳，應(yīng)用前景廣闊。目前臨床醫(yī)學(xué)常結(jié)合控制血糖的基礎(chǔ)治療和直接作用于糖尿

2、病足局部病灶中藥外用，可使藥物直達(dá)病灶，解決由于肢體末端血液循環(huán)差因而全身藥物不能到達(dá)的弊端，采用多靶點(diǎn)治療促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合，使局部發(fā)生潰瘍、化膿、腐爛等癥狀的時(shí)間明顯縮短，并且安全性較高，尚未見副作用的報(bào)道，病人樂于接受治療。由于糖尿病足潰瘍與普通創(chuàng)面不同，慢性難愈，愈后易留疤痕，給患者身體和精神上帶來巨大的痛苦，也給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，開發(fā)能夠兼?zhèn)漕A(yù)防糖尿病早期末梢循環(huán)障礙，延緩足潰瘍發(fā)生的同時(shí)又能有效促進(jìn)

3、足潰瘍發(fā)展期創(chuàng)面愈合，減輕患者痛苦，降低截肢率的新藥已成為治療糖尿病足潰瘍的重點(diǎn)及難點(diǎn)。
　　前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外用生膚油具有益氣活血、祛瘀生肌之功效，能促進(jìn)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面快速愈合，其機(jī)制涉及修復(fù)末期下調(diào)環(huán)氧化酶2（COX-2）、β-連環(huán)素（β-catenin）的高表達(dá)，這些提示了生膚油對(duì)病理性創(chuàng)面修復(fù)具有明顯的療效。本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病足潰瘍?cè)缙诩鞍l(fā)展期的大鼠模型，檢測(cè)給藥前后的足部溫度、熱痛閾值、創(chuàng)面大體變化、創(chuàng)面面積變化及修復(fù)末期

4、創(chuàng)面組織中相關(guān)蛋白COX-2、β-catenin及VEGF的表達(dá)探討生膚油防治糖尿病足潰瘍的機(jī)制；利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中模擬糖尿病足潰瘍病理修復(fù)中的持續(xù)炎癥狀態(tài)，通過檢測(cè)成纖維細(xì)胞的遷移能力以及 COX-2、β-catenin的表達(dá)變化，探討成纖維細(xì)胞遷移過程中COX-2、β-catenin的調(diào)控機(jī)制。
　　目的：
　　本課題主要研究生膚油預(yù)防糖尿病大鼠足潰瘍?cè)缙诘陌l(fā)生，促進(jìn)糖

5、尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合及其作用機(jī)制；同時(shí)探討 COX-2、β-catenin的異常調(diào)節(jié)與成纖維細(xì)胞遷移之間的關(guān)系，為今后進(jìn)一步推廣生膚油在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)。生膚油防治糖尿病大鼠足潰瘍的作用機(jī)制研究
　　方法：
　　1、采用腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）結(jié)合足部低溫誘導(dǎo)，建立糖尿病大鼠足潰瘍?cè)缙谀Ｐ?。隨機(jī)將大鼠均分為非糖尿病組、糖尿病未治療組、二甲雙胍組、生膚油以及生膚油+二甲雙胍組，并根據(jù)分組給予生理鹽水或二甲雙胍灌胃（

6、200 mg/kg，1次/天）同時(shí)足底涂抹麻油或生膚油（0.15 ml/cm2，1次/天）治療3周。采用紅外測(cè)溫儀及足底測(cè)試儀分別測(cè)定給藥前及給藥1、2、3周后大鼠雙足底溫度和熱痛閾值，對(duì)數(shù)據(jù)行重復(fù)測(cè)量方差分析。
　　2、采用腹腔注射STZ結(jié)合足底高溫蒸汽燙傷（面積約37 mm2）建立糖尿病大鼠足潰瘍發(fā)展期模型。根據(jù)臨床采用口服降糖藥全身給藥、局部外用治療以及兩者相結(jié)合的治療原則設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)的給藥分組。隨機(jī)將大鼠均分為非糖尿病組、

7、糖尿病未治療組、二甲雙胍組、生膚油及生膚油+二甲雙胍組，并根據(jù)分組給予生理鹽水或二甲雙胍灌胃（200 mg/kg，1次/天）同時(shí)足底涂抹麻油或生膚油（0.15 mL/cm2，1次/天）治療35天。治療3、7、21、35天觀察各組創(chuàng)面大體變化并記錄創(chuàng)面面積；治療35天處死各組大鼠，取創(chuàng)面全層皮膚組織，部分切片經(jīng)H&E染色后行組織形態(tài)學(xué)觀察，部分切片用于進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用多光譜顯微成像系統(tǒng)定量創(chuàng)面組織中環(huán)氧化酶2（COX-2）、β-

8、連環(huán)素（β-catenin）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，對(duì)數(shù)據(jù)行重復(fù)測(cè)量方差分析及雙因素方差分析。
　　3、利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)結(jié)合細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，模擬糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的病理性愈合過程，并檢測(cè)成纖維細(xì)胞的遷移能力以及COX-2，β-catenin的表達(dá)。分別給予COX-2的抑制劑NS398，β-catenin的抑制劑DKK-1后觀察24 h內(nèi)細(xì)胞遷移的距離，Western blotting法檢測(cè)COX-2、β-cate

9、nin的相對(duì)表達(dá)水平。對(duì)數(shù)據(jù)行單因素方差分析。
　　結(jié)果：
　　1、生膚油能改善糖尿病足潰瘍?cè)缙谧悴康蜏丶巴从X遲鈍：給藥2、3周，生膚油+二甲雙胍組大鼠足溫有所升高并明顯高于糖尿病未治療組，且與非糖尿病組無明顯差異；給藥3周，二甲雙胍組、生膚油組大鼠足溫均與非糖尿病組的無明顯差異。給藥前、后3周期間，糖尿病未治療組大鼠始終呈高痛閾值，二甲雙胍組、生膚油組、生膚油+二甲雙胍組大鼠熱痛閾值均逐步降低。
　　2、生膚油能促進(jìn)

10、糖尿病足潰瘍發(fā)展期創(chuàng)面愈合：①創(chuàng)面大體觀表明治療3~35天，生膚油組及生膚油+二甲雙胍組創(chuàng)面愈合優(yōu)于其它組。②創(chuàng)面面積比較結(jié)果表明治療7 d，5組大鼠創(chuàng)面面積均明顯增大。治療21 d、35 d糖尿病未治療組大鼠創(chuàng)面面積始終最大且明顯大于非糖尿病組，生膚油組、生膚油+二甲雙胍組大鼠創(chuàng)面面積縮小并明顯小于糖尿病未治療組，且與非糖尿病組無顯著性差異。③H&E染色結(jié)果顯示，生膚油組及生膚油+二甲雙胍組創(chuàng)面皮膚結(jié)構(gòu)較為完整，真皮層炎性細(xì)胞浸潤較少

11、，創(chuàng)緣處膠原纖維排列較整齊。④免疫組織化學(xué)染色及定量結(jié)果顯示，治療35d相比糖尿病未治療組，生膚油組及生膚油+二甲雙胍組創(chuàng)面組織中 COX-2表達(dá)明顯下調(diào)，VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，生膚油組中β-catenin的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　3、LPS呈劑量及時(shí)間依賴的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的遷移，且伴隨了 COX-2、β-catenin的過表達(dá)。而通過抑制 COX-2、β-catenin的過表達(dá)抑制了成纖維細(xì)胞的過度遷移。
　　結(jié)論：