厄貝沙坦對糖尿病大鼠足細胞的保護作用及其可能機制.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)危害最大的微血管并發(fā)癥之一,確切的發(fā)病機制尚未完全闡明。腎小球臟層上皮細胞,即足細胞(podocyte)損傷改變在糖尿病腎病出現(xiàn)蛋白尿及發(fā)展過程中起重要作用。DN早期即出現(xiàn)足細胞損傷,進一步發(fā)展為出現(xiàn)蛋白尿,加速腎臟病變進展。目前關(guān)于在糖尿病腎病早期足細胞損傷的機制并不十分清楚。近年來已認識到足細胞上某些蛋白分子參與信號的傳遞,對維持足細胞正常結(jié)構(gòu)起著重要作用,它們的突變或缺失

2、可導(dǎo)致足細胞結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變,引起蛋白尿和腎小球硬化的發(fā)生。α3β1整合素是足細胞粘附于腎小球基底膜(GBM)的主要粘附分子,參與維持足細胞正常形態(tài)、GBM通透性和足細胞內(nèi)外信號的傳導(dǎo)。予足細胞α3β1整合素拮抗劑,足細胞與細胞外基質(zhì)粘附力下降,凋亡增加。α3或β1整合素缺失鼠腎臟腎小球基底膜斷裂層化,濾過屏障受損,足突退化,足細胞密度嚴重減少,產(chǎn)生大量蛋白尿。糖尿病患者或糖尿病大鼠足細胞整合素α3β1整合素的表達受抑,并隨病程的延長、血

3、糖的升高,這種抑制作用加重。有研究顯示機械應(yīng)力、血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子β1、活性氧等均可調(diào)控足細胞α3β1整合素表達。
　　 厄貝沙坦(Irbesatan)是一種高選擇性的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的AT1受體拮抗劑(ARB),大量基礎(chǔ)臨床證據(jù)顯示厄貝沙坦可選擇性與AngⅡ1型受體結(jié)合,阻斷AngⅡ-醛固酮系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng),通過阻斷腎小球出球小動脈的AngⅡ受體導(dǎo)致出球小動脈擴張,直接降低腎小球灌注壓減少尿蛋白濾過還可阻斷.A

4、ngⅡ介導(dǎo)的增大腎小球濾過膜孔徑的作用,改善濾過膜通透性,減少蛋白漏出,且其腎臟保護作用呈劑量依賴性。因此我們提出以下假設(shè):厄貝沙坦的劑量保護效應(yīng)可獨立于降壓作用外,通過調(diào)控腎臟局部AngⅡ影響腎組織α3β1整合素表達,減少足細胞丟失,進而改善濾過屏障受損、延緩糖尿病腎病病變。
　　 本研究擬通過整體研究,予不同劑量厄貝沙坦干預(yù)糖尿病大鼠,觀察腎臟局部.AngⅡ、腎組織α3β1整合素、腎小球足細胞密度變化,闡明各因素的相關(guān)性,為

5、厄貝沙坦劑量相關(guān)的腎臟保護作用機制提供部分動物實驗依據(jù),為糖尿病腎病預(yù)防與應(yīng)對措施提供新思路。
　　 第一章 厄貝沙坦對糖尿病大鼠獨立于降壓以外的腎臟保護作用及其劑量相關(guān)性探討
　　 [目的]
　　 1、觀察不同劑量厄貝沙坦對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠尿微量白蛋白排泄率、腎小球足細胞數(shù)量、腎臟病理的影響；
　　 2、探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護作用及其劑量相關(guān)性。
　　 [方法]
　　 1、

6、糖尿病大鼠模型的制備和分組:63只雄性Wistar大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心),體重240～280g。按體重分層后隨機分為3組,分別為正常對照組(Ctrl組,n=7)、糖尿病對照組(DM組,n=14)和藥物干預(yù)組(n=42)。禁食過夜后,糖尿病對照組和藥物干預(yù)組大鼠56只一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)55mg/kg,72小時后剪尾取血,測尾血全血血糖>16.7mmol/L,作為糖尿病模型。造模過程中,DM組死亡3只,藥物干預(yù)組死

7、亡6只。藥物干預(yù)組糖尿病大鼠按體重再次隨機分為4組,于造模成功4周后分別給予25mg/kg·d厄貝沙坦(DM+Irb25組,n=9)、50mg/kg·d厄貝沙坦(DM+Irb50組,n=9)、200mg/kg·d厄貝沙坦(DM+Irb200組,n=9)和30mg/kg·d肼屈嗪(DM+Hyd組,n=9)干預(yù)8周。造模后前4周,對血糖值≥30mmol/L的糖尿病大鼠予皮下注射長效胰島素來得時(Sanofi-anvitis公司,法國),2～

8、4IU/隔日,以避免酮癥的出現(xiàn)和保持大鼠生命活力。
　　 2、厄貝沙坦(Sanofi-anvitis公司,法國)及肼屈嗪(Sigma,美國)用藥量根據(jù)大鼠體重計算。溶于清潔飲水中灌胃給藥,每天一次。正常對照組和糖尿病對照組給予相應(yīng)體積飲水灌胃。所有大鼠飼養(yǎng)于恒溫清潔環(huán)境(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心),自由進食及飲水。
　　 3、給藥前及給藥8周后,采用Powerlab生物信息采集系統(tǒng)(Adinstrument,澳大利亞)測

9、大鼠尾動脈收縮期血壓,待大鼠充分平靜后,連續(xù)測鼠尾動脈收縮期血壓三次,取其平均值為該鼠收縮期血壓值。
　　 4、標本的留取:給藥8周后,大鼠放入代謝籠,留取24小時尿液,計量尿量,尿液離心30分鐘(4℃,4000rpm),取上清分裝后于-70℃凍存,用于尿肌酐及尿微量白蛋白的檢測。大鼠麻醉后,經(jīng)腹主動脈插管,4℃ PBS灌注后取腎臟。迅速剝?nèi)ツI包膜,稱量腎重后縱向剖開腎臟,切取約0.5x0.5x0.2cm3大小的腎臟組織,置于1

10、0％中性福爾馬林緩沖溶液中固定24小時,剩余部分放入凍存管中液氮保存。
　　 5、尿微量白蛋白排泄率的檢測:24小時尿微量白蛋白含量使用ELISA試劑盒(Rat albumin ELISA quatitation kit,Behtyl Laboratodes,美國)檢測。
　　 6、腎組織形態(tài)學(xué)觀察:10％中性福爾馬林緩沖溶液固定,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。2μm石蠟切片,過碘酸席夫氏染色(PAS)染色,光鏡下觀察腎組織形態(tài)

11、學(xué)變化。①每個腎小球橫截面積(Ag),每張切片隨機至少取20個腎小球,以Imagepro plus 6.0測其截面積,取其平均值。②腎小球體積(Vg),計算公式3/2Vg=1.25x(Ag)3/2。
　　 7、腎小球足細胞密度測定:10％中性福爾馬林緩沖溶液固定,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、5μm石蠟切片。兔抗大鼠WT1多克隆抗體(Merk公司)免疫組化SP法檢測腎小球WT1表達,Image-Pro Plus 6.0彩色圖像分析系統(tǒng)半

12、定量足細胞密度。
　　 8、統(tǒng)計方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差((x)±SD)表示。各組間計量資料的分析采用One-way ANOVA和協(xié)方差分析,當P<0.05時用LSD法作多重比較。方差不齊性時,用Welch法校正,當P<0.05時用Games-Howell法作多重比較。干預(yù)前后計量資料的分析采用獨立樣本t檢驗。大鼠尾血全血血糖值的比較用多個獨立樣本非參數(shù)(Kruskal-W

13、allis H)檢驗。雙變量不符合正態(tài)分布,相關(guān)分析采用Sperman相關(guān)分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1、厄貝沙坦顯著降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白、減輕腎臟肥大、腎小球肥大,改善足細胞的減少,延緩糖尿病大鼠腎臟病變的進展；在一定劑量范圍范圍內(nèi),厄貝沙坦的的腎臟保護作用呈劑量依賴性。
　　 2、糖尿病大鼠足細胞的丟失可能是蛋白尿發(fā)生的因為之一。
　　 3、厄貝沙坦可能還具

14、有降壓以外的改善濾過屏障、延緩糖尿病腎病病變的作用。其具體機制尚有待于進一步的研究。
　　 第二章 厄貝沙坦對糖尿病大鼠腎臟局部AngⅡ、腎小球α3β1整合素表達的影響
　　 [目的]
　　 觀察厄貝沙坦(Irbesartan)對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟局部AngⅡ水平、及腎α3β1整合素表達的影響并分析其劑量相關(guān)性。探討厄貝沙坦對糖尿病大鼠腎臟保護作用的途徑,為ARBs的臨床應(yīng)用提供一定的動物實驗依據(jù),為探索

15、DN的發(fā)病機制、開發(fā)新藥提供部分實驗依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、糖尿病大鼠模型的制備和分組 同第一章。
　　 2、厄貝沙坦、肼屈嗪灌胃給藥 同第一章。
　　 3、標本的留取 給藥8周后,大鼠麻醉,經(jīng)腹主動脈4℃ PBS灌注后取腎臟,腎臟縱向剖開后,切取約0.5x0.5x0.2cm3大小的組織,置于10％中性甲醛緩沖溶液中固定,剩余組織于凍存管中液氮凍存。
　　 5、腎α3整合素、β1整合素m

16、RNA的測定:Trizol法提取腎皮質(zhì)(液氮中凍存組織)總RNA。Real time RT-PCR檢測腎皮質(zhì)α3整合素、β1整合素mRNA表達情況,以GAPDH作為內(nèi)參。
　　 6、腎臟局部AngⅡ的檢測:從液氮中取出凍存的腎組織(腎皮質(zhì))移入1.5ml的EP管中,用冰浴的0.9％生理鹽水沖洗后剪碎,加入1mL 0.1 mol/L的冰醋酸中,4℃下用勻漿器制成勻漿,95℃水浴10min,冷卻后4℃,15000rmp,離心20mi

17、n,吸取上清液于EP管。按大鼠血管緊張素ⅡELISA試劑盒說明書進行操作。
　　 7、統(tǒng)計方法
　　 所有數(shù)據(jù)由SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,以均數(shù)±標準差((x)±SD)表示,符合正態(tài)分布和方差齊性時用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),進一步組間多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。變量相關(guān)分析時,采用person相關(guān)分析和偏相關(guān)分析。
　　 [結(jié)論]
　　 1、糖尿病大鼠腎