厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠降壓以外的腎臟保護(hù)作用及其可能機(jī)制.pdf

1、目前對(duì)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全弄清楚。已經(jīng)證實(shí)，血糖升高是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，然而有效的控制血糖并不能完全阻止糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。近年的研究表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在糖尿病腎病的發(fā)病中具有重要作用。 ACE是Ang Ⅰ轉(zhuǎn)化為Ang Ⅱ最重要的酶，ACE在體內(nèi)表達(dá)廣泛。生理情況下，腎臟ACE主要表達(dá)于腎皮質(zhì)近端腎小管刷狀緣，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2 （ACE2）與ACE具

2、有42%的同源性；與ACE廣泛表達(dá)不同，ACE2主要高表達(dá)于心臟、腎臟和睪丸，提示其在心血管、腎臟及生育功能中發(fā)揮調(diào)控作用。生理情況下，ACE2在人腎臟中主要分布于近端腎小管刷狀緣，少量位于腎小球上皮細(xì)胞，小葉動(dòng)脈內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞，以及中小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，但系膜細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)ACE2表達(dá)。ACE2酶切Ang Ⅱ生成拮抗Ang Ⅱ的Ang（1-7），此外，ACE2還可以將Ang Ⅰ轉(zhuǎn)化為Ang（1-9）。由此可見(jiàn)，ACE和ACE2在維持腎內(nèi)An

3、g Ⅱ的平衡中具有重要作用。目前認(rèn)為糖尿病早期，在尚未出現(xiàn)明顯的腎臟病變時(shí)，腎臟ACE表達(dá)降低，而ACE2的表達(dá)增加。這可能是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制。當(dāng)腎臟出現(xiàn)明顯病變時(shí)，腎臟ACE表達(dá)升高，而ACE2的表達(dá)降低。國(guó)內(nèi)有研究表明ARBs類(lèi)藥物纈沙坦可以顯著升高糖尿病大鼠腎臟ACE2 mRNA和蛋白的表達(dá)。由此，本研究推測(cè)ARBs降壓以外的腎臟保護(hù)作用可能部分是通過(guò)下調(diào)ACE和上調(diào)ACE2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 鑒于此，本研究以分別以不同劑量

4、厄貝沙坦干預(yù)糖尿病大鼠8周，觀察尿微量白蛋白排泄率、肌酐清除率及腎臟病理改變；并以肼屈嗪作為降壓的陽(yáng)性對(duì)照，探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護(hù)作用及其劑量相關(guān)性。此外，觀察厄貝沙坦干預(yù)下糖尿病大鼠腎臟局部ACE和ACE2蛋白的表達(dá)及其劑量相關(guān)性，初步探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。 第一章、厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠降壓以外的腎臟保護(hù)作用及其劑量相關(guān)性。 目的： 1、觀察不同劑量厄貝沙坦對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大

5、鼠尿微量白蛋白排泄率、肌酐清除率、腎臟病理的影響； 2、探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護(hù)作用及其劑量相關(guān)性。 方法： 1、糖尿病大鼠模型的制備和分組：63只雄性Wistar大鼠（購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重240～280g。按體重分層后隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組（Ctrl組，n=7）、糖尿病對(duì)照組（DM組，n=14）和藥物干預(yù)組（n=42）。禁食過(guò)夜后，糖尿病對(duì)照組和藥物干預(yù)組大鼠56只一次性腹腔注射鏈

6、脲佐菌素（STZ，Sigma公司，美國(guó)）55mg/kg（溶于0.01mol/L枸櫞酸緩沖液，pH4.5），72小時(shí)后剪尾取血，以血糖儀（One touch ultra，強(qiáng)生公司，美國(guó)）測(cè)尾血全血血糖> 16.7mmol/L作為糖尿病模型。造模過(guò)程中，DM組死亡3只，藥物干預(yù)組死亡6只。藥物干預(yù)組糖尿病大鼠按體重再次隨機(jī)分為4組，于造模成功4周后分別給予25mg/kg·d厄貝沙坦（DM+Irb25組，n=9）、50mg/kg·d厄貝沙坦（

7、DM+Irb50組，n=9）、200mg/kg·d厄貝沙坦（DM+Irb200組，n=9）和30mg/kg·d肼屈嗪（DM+Hyd組，n=9）干預(yù)8周。造模后前4周，對(duì)血糖值≥30mmol/L的糖尿病大鼠予皮下注射長(zhǎng)效胰島素來(lái)得時(shí)（Sanofi-anvitis公司，法國(guó)），2～4 IU/隔日，以避免酮癥的出現(xiàn)和保持大鼠生命活力。 2、厄貝沙坦（Sanofi-anvitis公司，法國(guó)）及肼屈嗪（Sigma，美國(guó)）用藥量根據(jù)大鼠體重

8、計(jì)算。溶于清潔飲水中灌胃給藥，每天一次。正常對(duì)照組和糖尿病對(duì)照組給予相應(yīng)體積飲水灌胃。所有大鼠飼養(yǎng)于恒溫清潔環(huán)境（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），自由進(jìn)食及飲水。 3、給藥前及給藥8周后，采用Powerlab生物信息采集系統(tǒng)（Adinstrument，澳大利亞）測(cè)大鼠尾動(dòng)脈收縮期血壓，待大鼠充分平靜后，連續(xù)測(cè)鼠尾動(dòng)脈收縮期血壓血壓三次，取其平均值為該鼠收縮期血壓值。 4、標(biāo)本的留取：給藥8周后，大鼠放入代謝籠，留取24小時(shí)尿

9、液，計(jì)量尿量，尿液離心30分鐘（4℃，4000rpm），取上清分裝后于-70℃凍存，用于尿肌酐及尿微量白蛋白的檢測(cè)。大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管取血4ml于促凝管，室溫下放置2小時(shí)后，離心15分鐘（4℃，3000rpm），留取血清待測(cè)血肌酐。4℃PBS灌注后取腎臟。迅速剝?nèi)ツI包膜，稱(chēng)量腎重后縱向剖開(kāi)腎臟，切取約0.5×0.5×0.2cm3大小的腎臟組織，置于10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定24小時(shí)。 5、生化指標(biāo)檢測(cè)：全自動(dòng)生化分

10、析儀檢測(cè)血肌酐（Scr）和尿肌酐（Ucr）濃度。結(jié)合血、尿肌酐，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）。 Ccr（ml/min/kg）=（尿肌酐×24小時(shí)尿量）/（血肌酐×1440min×大鼠體重） 6、尿微量白蛋白排泄率的檢測(cè)：24小時(shí)尿微量白蛋白含量使用ELISA試劑盒（Rat albumin ELISA quatitation kit，Behtyl Laboratories，美國(guó)）檢測(cè)。 7、腎組織形態(tài)學(xué)觀察：10%

11、中性福爾馬林緩沖溶液固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。2μm石蠟切片，過(guò)碘酸席夫氏染色（PAS）染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。①每個(gè)腎小球橫截面積（Ag），每張切片隨機(jī)至少取20個(gè)腎小球，以Imagepro plus 5.1測(cè)其截面積，取其平均值。②腎小球體積（Vg），計(jì)算公式Vg=1.25×（Ag）3/2 8、統(tǒng)計(jì)方法。 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。各組間計(jì)量資料的分析采

12、用One-way ANOVA，當(dāng)P<0.05時(shí)用LSD法作多重比較。方差不齊性時(shí)，用Welch法校正，當(dāng)P<0.05時(shí)用Games-Howell法作多重比較。干預(yù)前后計(jì)量資料的分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。大鼠尾血全血血糖值的比較用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、厄貝沙坦顯著降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白、肌酐清除率，減輕腎臟肥大、腎小球肥大，延緩糖尿病大鼠腎臟病變的進(jìn)展；在一定劑量范圍范

13、圍內(nèi)，厄貝沙坦的的腎臟保護(hù)作用呈劑量依賴(lài)性。 2、在降壓劣于肼屈嗪的情況下，厄貝沙坦降低尿微量白蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大和腎小球肥大的作用顯著優(yōu)于肼屈嗪，說(shuō)明厄貝沙坦還具有降壓以外的腎臟保護(hù)作用。其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。 第二章、厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟局部RAS主要成分的影響。 目的： 觀察厄貝沙坦（Irbesartan）對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟局部ACE和ACE2蛋白表達(dá)的影響及其劑量相

14、關(guān)性。探討厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制，為ARBs的臨床應(yīng)用提供一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、糖尿病大鼠模型的制備和分組。 同第一章。 2、厄貝沙坦、肼屈嗪灌胃給藥。 同第一章。 3、標(biāo)本的留取 給藥8周后，大鼠麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管取血4ml于酶抑制劑抗凝管，小心上下輕輕顛倒幾次，混勻后即刻放入4℃冰箱中2小時(shí)，取出后離心7分鐘（4℃，2500rpm），留取血漿，分裝后

15、-70℃凍存。4℃PBS灌注后取腎臟，腎臟縱向剖開(kāi)后，切取約0.5×0.5×0.2cm3大小的組織，置于10%中性甲醛緩沖溶液中固定。 4、血漿血管緊張素Ⅱ的檢測(cè)。 用血漿血管緊張素Ⅱ放射免疫試劑盒檢測(cè)（北京北方生物技術(shù)研究所）。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行。 5、免疫組化法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)Ang Ⅱ、ACE和ACE2蛋白的表達(dá)。 10%中性甲醛固定液固定腎臟組織后，常規(guī)組織脫水、浸蠟、包埋、切片。兔抗大鼠A

16、ngⅡ多克隆抗體（1：200，武漢博士德公司）檢測(cè)腎組織AngⅡ的分布和表達(dá)；兔抗大鼠ACE多克隆抗體（1：100，Santa Cruz，美國(guó)）檢測(cè)腎組織ACE的分布和表達(dá)；兔抗大鼠ACE2多克隆抗體（1：100，Santa Cruz，美國(guó)）檢測(cè)腎組織ACE2的分布和表達(dá)。 6、統(tǒng)計(jì)方法。 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。各組間計(jì)量資料的分析采用One-way ANOVA，當(dāng)

17、P<0.05時(shí)用LSD法作多重比較。方差不齊性時(shí)，用Welch法校正，當(dāng)P<0.05時(shí)用Games-Howell法作多重比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、糖尿病大鼠循環(huán)及腎臟局部Ang Ⅱ水平的變化不一致，顯示糖尿病時(shí)，循環(huán)RAS系統(tǒng)處于正常的狀態(tài)，而腎臟局部RAS系統(tǒng)則處以激活狀態(tài)，與既往研究結(jié)果一致。說(shuō)明腎臟局部RAS系統(tǒng)的異常激活是導(dǎo)致糖尿病腎病的重要機(jī)制之一。 2、糖尿病大鼠腎臟局部