川芎嗪對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制研究.pdf

1、糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN），即糖尿病腎小球硬化，是糖尿?。―iabetes mellitus，，DM）嚴重的微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的重要原因。DM病人一旦進入臨床DN期（蛋白尿期），出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿，病程不可逆，治療相當困難，故強調(diào)預防。目前將DN的預防分為3級，其中一級預防是指正常白蛋白尿至微量白蛋白尿期的預防。DN的機制未明，近年來大量國內(nèi)外研究表明，多種因素參與了DN的發(fā)生、發(fā)展，細胞因子和

2、生長因子合成增加所起到的作用越來越受到重視，已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腎小球硬化及系膜基質(zhì)積聚中起關(guān)鍵作用，與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。使用TGF-β1、VEGF單克隆抗體可顯著改善糖尿病大鼠腎小球硬化。 川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP

3、）化學名為四甲基吡嗪.是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體，具有活血化瘀、抗血小板凝集、擴張血管等多種作用，因其治療作用好、副作用少而廣泛用于心腦血管疾病的治療。其腎臟保護作用在一系列臨床與實驗中已得到證實，但機制還不甚清楚。大量研究主要集中在川芎嗪對改善糖脂代謝，抑制血小板激活與聚集，改善血液流變等方面，尚少見到從生長因子合成和分泌方面觀察是否對糖尿病大鼠腎臟有保護作用的報道。本課題旨在觀察活血化瘀藥川芎之主要成分川芎嗪（簡稱TMP）

4、治療糖尿病腎病的療效，并探討其作用機制是否與影響生長因子TGF-p1和VEGF有關(guān)。 目的： 觀察川芎嗪對糖尿病大鼠一般情況、血糖水平、腎功能、尿蛋白水平、腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響；觀察川芎嗪對糖尿病大鼠腎臟VEGF、TGF-β1表達的影響。探討川芎嗪治療糖尿病腎病的療效及作用機制。 方法： 1、動物模型的制作選取雄性SPF級SD大鼠，體重180～220g，除正常對照組外，余大鼠均給予高脂高糖飲食（普通飼料：白

5、糖：豬油：雞蛋=14：3：2：1）6周后，禁食12h，采用1％STZ（臨用前用0.1mol/L、PH4.2枸櫞酸緩沖液配置，現(xiàn)配現(xiàn)用）按40mg/kg體重一次性腹腔注射。 2、模型納入標準注射STZ72小時后至少連續(xù)3d尾靜脈采血檢測血糖，隨機血糖≥16.65mmol/L者納入實驗。 3、試驗分組與用藥除正常對照組外，另將造模成功的大鼠隨機分為TMP80mg/（kg，d）組、160mg/（kg.d）組、25mg/（kg.

6、d）卡托普利組、模型對照組，每組6只，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)8周。 4、檢測指標8周后結(jié)束治療，留取大鼠24小時尿液、采集血標本、摘取腎臟稱重，觀察腎臟外形并拍照后處死大鼠。切取腎臟，HE及PAS染色進行形態(tài)學病理檢察。免疫組化法檢測各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1蛋白的表達。RT-PCR法檢測各組大鼠腎組織VEGFmRNA及TGF-β1mRNA的表達。 結(jié)果： 1、TMP對各組糖尿病大鼠代謝指標的影響動物

7、造模8周后，測各組DM大鼠RBS、HbA1c值，各DM組均明顯高于正常組。TMP治療組與模型組比較，其血糖水平略有下降，但組間差異無統(tǒng)計學意義，表明川芎嗪降糖作用不明顯。DM模型組依其自然病程，在試驗結(jié)束時，全部大鼠尿蛋白/肌酐（Upro/Ucr）比值均大于300mg/gcr，部分大鼠出現(xiàn)血肌酐升高，說明模型組大鼠已進入DNIV或V期，即臨床蛋白尿期或尿毒癥，病程已不可逆。TMP各治療組與DM模型組比較，Upro/Ucr水平明顯較低，且

8、TMP160mg/kg組大鼠Upro/Ucr均低于或者輕度高于300mg/gcr，血肌酐尚在正常范圍內(nèi)，與DM模型組有顯著差異（p<0.05），屬DNⅢ期，說明使用TMP治療DM大鼠，能有效防治DN的發(fā)生和發(fā)展。 2、川芎嗪對大鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響給藥8周后，腎臟組織HE及PAS染色光鏡下觀察顯示，正常對照組大鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)正常；DM模型組表現(xiàn)為腎小球肥大、毛細血管袢擴張，伴系膜組織增殖，出現(xiàn)局灶節(jié)段性腎小球硬化，腎間質(zhì)

9、明顯局灶炎性分布及淋巴細胞浸潤，腎小管擴張，基底膜明顯增厚。各治療組與模型組比較以上病理改變有不同程度的減輕。各DM組大鼠PAS陽性區(qū)域面積均明顯高于正常對照組，系膜區(qū)明顯增厚增寬，說明糖尿病模型對大鼠腎臟有明顯的病理損害。TMP160mg/kg組大鼠腎臟PAS陽性區(qū)域較模型組有明顯降低，提示給予TMP160mg/kg能抑制或者降低STZ所致DM大鼠的系膜增寬增厚，對DN大鼠腎臟有較好的保護作用。 3、TMP對大鼠腎臟TGF-β

10、1、VEGF表達的影響免疫組化圖像結(jié)果顯示：TGF-β1、VEGF陽性細胞胞漿染色為棕黃色。正常組腎臟組織僅檢出極少量TGF-β1、VEGF的表達，模型組TGF-β1、VEGF的表達顯著增加，陽性細胞數(shù)量多而密集，染色較深。各治療組腎皮質(zhì)TGF-β1、VEGF蛋白的表達也增高，但TMP160 mg/kg組與模型組比較，陽性細胞數(shù)較少而淺，IPP軟件分析其累計光密度值與模型組相比均顯著降低（P<0.05）。 4、TMP對大鼠腎臟T

11、GF-β1mRNA、VEGF mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：正常組腎臟組織TGF-β1mRNA、VEGFmRNA表達極低，各DM組，腎臟組織TGF-β1mRNA、VEGFmRNA的表達均增高。TMP160 mg/kg劑量組與模型對照組比較，TGF-β1mRNA、VEGFmRNA的表達均顯著降低（P<0.05），與免疫組化的結(jié)果相符。 結(jié)論： 1、川芎嗪可抑制糖尿病腎病的發(fā)展，減少蛋白尿的排泄，改善糖