仙草水提物對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用及其作用機制的研究.pdf

1、本論文首先參照衛(wèi)生部《食品安全性毒理學評價程序和方法》要求對仙草水提物進行急性毒性和遺傳毒性的研究。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型，通過病理觀察、免疫組化、ELISA、實時熒光定量PCR等多種研究手段，從整體、細胞、分子等不同水平系統(tǒng)觀察了仙草水提物對實驗大鼠血糖、血脂及腎功能的影響，并利用大鼠腎系膜細胞初步探討了仙草的抗脂質(zhì)過氧化特性在DN防治中的可能作用機制。
　　 第一部分：仙草水提物的急性毒性和遺傳毒性研

2、究
　　 目的：對仙草水提物進行急性毒性和遺傳毒性的研究，為其開發(fā)利用提供部分毒理學實驗依據(jù)。
　　 方法：仙草經(jīng)熱水浸提、減壓濃縮和干燥粉碎后獲得棕色粉末備用。對仙草水提物進行大、小鼠急性毒性試驗，Ames試驗，小鼠骨髓微核試驗和小鼠精子畸形試驗的研究。
　　 結(jié)果：染毒后，大、小鼠在2周的觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)任何中毒癥狀和死亡情況；雌、雄性大小鼠對該受試物的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量均大于24.0g/kg體重；Am

3、es試驗中，不同劑量受試物在加大鼠肝勻漿代謝活化系統(tǒng)和不加S9條件下的回變菌落數(shù)均未超過空白對照組和溶劑對照組回變菌落數(shù)的兩倍，且各劑量組間無明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系；各劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率和精子畸形率明顯低于陽性對照組，且與陰性對照組無顯著性差異。
　　 第二部分：仙草水提物對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用
　　 目的：應(yīng)用STZ誘導的糖尿病大鼠模型，觀察仙草水提物對實驗動物體重、血糖、血脂以及腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

4、。同時，檢測實驗動物腎組織中抗氧化指標MDA和SOD、GSH-Px的水平，以及致纖維化因子TGF-β１、TSP-1和FN基因表達的變化，從而探討仙草水提物在DN防治中的作用及其可能的分子機制。
　　 方法：糖尿病大鼠模型制備及分組
　　 清潔級雄性SD大鼠，體重180-200g，造模前禁食10小時，以60mg/kg體重的劑量一次性腹腔注射STZ。正常對照組大鼠腹腔注射等劑量檸檬酸鹽緩沖液。72小時后大鼠尾靜脈采血，使用血

5、糖儀測定血糖水平，尿糖試紙測定尿糖水平。將血糖≥16.7mmol/L、尿糖陽性視為糖尿病大鼠模型制備成功。
　　 (1)糖尿病對照組；
　　 (2)低劑量仙草干預組；
　　 (3)中劑量仙草干預組；
　　 (4)高劑量仙草干預組；
　　 (5)吡格列酮干預組；
　　 各干預組大鼠于每周上午灌胃給予受試物一次，正常和糖尿病對照組大鼠用等量蒸餾水灌胃。實驗期間，所有大鼠自由進食及飲水，每天觀察

6、大鼠的一般狀況，監(jiān)測體重和血糖、尿糖水平的變化，持續(xù)給予受試物6周后處死。
　　 大鼠麻醉前先收集尿液，并置于4℃保存；然后以40mg/kg.體重的劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉，將大鼠充分麻醉后固定于鼠板上，打開腹腔，腹主動脈取血，3000rpm離心15分鐘，留取血清，分裝后-70℃凍存。迅速采集腎臟標本，取部分腎組織標本，以4％中性甲醛固定，用于HE染色和免疫組化檢測。另取腎臟髓質(zhì)交界處皮質(zhì)1mm3大小之腎組織數(shù)小塊，以2.5％

7、戊二醛固定，用于透射電鏡檢查。余下的腎臟組織分裝后液氮凍存，用于腎勻漿中的抗氧化酶活性檢測和實時熒光定量PCR檢測。
　　 血、尿標本用全自動生化分析儀檢測血糖、血總膽固醇、甘油三酯、低密度膽固醇酯蛋白、高密度膽固醇酯蛋白、血肌酐、血尿素氮。
　　 尿微量白蛋白采用化學發(fā)光法于全自動蛋白分析系統(tǒng)測定。
　　 光鏡和電鏡觀察腎組織病理變化。
　　 采用試劑盒的方法檢測大鼠腎勻漿中MDA和SOD、GSH-Px

8、的水平。
　　 采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中OxLDL的水平。
　　 Trizol法提取腎組織中總RNA，熒光實時PCR定量檢測TGF-β1、TSP-1和FN的mRNA表達。
　　 免疫組化法標記腎組織內(nèi)TGF-β１、TSP-1和FN的陽性細胞。
　　 結(jié)果：
　　 腹腔注射STZ后，實驗大鼠均出現(xiàn)了不同程度的血糖升高、尿糖陽性、體重減輕、飲水量和尿量明顯增加等糖尿病典型癥狀。造模6周后，糖

9、尿病組大鼠體重明顯低于正常對照組，血糖明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義；各干預組大鼠的一般狀況與糖尿病組比較有明顯改善，體重明顯高于糖尿病組，高劑量仙草干預組體重差異可見統(tǒng)計學意義；但各干預組大鼠的血糖水平與糖尿病組比較，差異均未見統(tǒng)計學意義。
　　 糖尿病組大鼠的血尿素氮、肌酐和尿微量白蛋白水平均明顯高于正常對照組；吡格列酮和仙草低、中、高劑量干預組的尿微量白蛋白水平明顯低于糖尿病組大鼠；吡格列酮和仙草各劑量組大鼠的血尿

10、素氮和肌酐水平均未見明顯改變，顯著高于正常對照組水平。
　　 糖尿病組大鼠的血清LDL、HDL、TG和TC值明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義；各劑量仙草干預組的LDL和TC水平，隨著仙草受試物濃度增大而存在降低的趨勢；吡格列酮和高劑量仙草干預組大鼠的各項血脂指標除TG外均明顯下降，與糖尿病組比較有統(tǒng)計學意義。
　　 肉眼觀察可見糖尿病大鼠腎臟體積增大，外觀蒼白、腫脹；在光鏡下可見部分腎小球萎縮，囊腔增大；腎小管管腔變

11、窄，上皮細胞肥大、胞漿內(nèi)出現(xiàn)糖原空泡；電鏡下發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小球基底膜厚薄不均勻，部分區(qū)域呈局灶性增厚，足突排列紊亂，融合增加，腎小管上皮細胞線粒體腫脹，微絨毛排列紊亂或部分脫落，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多空泡。吡格列酮和仙草水提物的干預能明顯促進糖尿病大鼠腎臟病變的好轉(zhuǎn)，光鏡下腎小球結(jié)構(gòu)相對清晰，萎縮少見，囊腔增大和腎小管上皮細胞空泡現(xiàn)象明顯改善；而電鏡下可見腎小球基底膜變清晰，足突融合、腎小管上皮細胞的線粒體腫脹、絨毛脫落和胞內(nèi)空泡現(xiàn)象明顯改

12、善。MDA含量和抗氧化酶活性的變化
　　 糖尿病大鼠腎組織的MDA含量明顯高于正常對照組，仙草低、中、高劑量干預組的MDA含量均明顯低于糖尿病組，差異具有統(tǒng)計學意義；但SOD和GSH-Px的活性未見明顯變化。吡格列酮干預組的上述指標與正常對照組和糖尿病組比較，差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 糖尿病大鼠血清中OxLDL的含量明顯高于正常對照組；吡格列酮干預組和仙草中劑量干預組的OxLDL水平明顯低于糖尿病大鼠組，差異具有統(tǒng)計學

13、意義。
　　 實時熒光定量PCR的結(jié)果表明：糖尿病大鼠腎組織中TSP-1、TGF-β1和FN的mRNA表達水平均高于正常對照組，各干預組三種細胞因子的mRNA表達與糖尿病組比較均有不同程度的下降；且隨著仙草受試物濃度的增大，TGF-β1和TSP-1的mRNA表達存在下降趨勢，但以上變化均未見統(tǒng)計學意義。
　　 免疫組化方法檢測到糖尿病大鼠腎組織切片中TGF-β1、TSP-1和FN陽性細胞數(shù)量和光密度值均明顯高于正常對照組

14、，差異具有統(tǒng)計學意義；各劑量仙草干預組受測細胞因子的表達顯著下降，其中仙草中劑量組的效果較為明顯，與糖尿病組比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 第三部分：仙草水提物對LDL體外氧化修飾作用和腎系膜細胞TGF-β1mRNA表達的影響
　　 目的：觀察仙草水提物對血漿LDL體外氧化修飾作用的影響，以及對OxLDL誘導的大鼠腎系膜細胞TGF-β1等細胞因子轉(zhuǎn)錄的影響，探討仙草水提物對糖尿病大鼠腎臟保護作用的可能機制。
　　

15、 方法：采用序列超速離心和Sepharose6B凝膠過濾分離純化的LDL，用10μmol/LCu2+進行氧化誘導，獲得OxLDL。在Cu2+誘導過程中加入不同濃度的仙草水提物，觀察其對體外Cu2+誘導的LDL氧化修飾作用的影響，結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳遷移率和硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)表示。體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，隨機分為空白對照組、氧化誘導組和仙草25、50和125μg/ml干預組，以維生素E作為陽性對照組。細胞共孵育24h后Trizol提

16、取總RNA，熒光定量PCR檢測各組細胞TGF-β1、TSP-1、FN的mRNA表達。
　　 結(jié)果：仙草水提物能明顯對抗Cu2+誘導的LDL氧化，其中高濃度組仙草水提物的遷移率與LDL未氧化組和VitE干預組幾乎相同，在實驗濃度范圍內(nèi)存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。25-125μg/ml仙草水提物均可顯著抑制過氧化脂質(zhì)的生成，與氧化修飾組比較，差異具有統(tǒng)計學意義；50μg/ml以上濃度仙草干預組的LPO抑制率趨于穩(wěn)定，接近氧化修飾組的5

17、0％。腎系膜細胞在OxLDL誘導下TGF-β1、FN的mRNA生成明顯增加，仙草低、中、高各劑量組能非常顯著地抑制腎系膜細胞在OxLDL誘導下TGF-β1mRNA的產(chǎn)生，抑制效果高于VitE對照組；對FN的抑制效果分別為對照組的1.40±0.09，1.33±0.16和1.17±0.21倍，其中高劑量組與誘導組比較，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、仙草水提物在本實驗劑量范圍內(nèi)，對實驗動物未見急性毒性和致突變作用

18、。
　　 2、仙草水提物可顯著增加STZ誘導的糖尿病大鼠的體重，改善一般狀況，但對血糖無明顯作用。
　　 3、仙草水提物對糖尿病大鼠腎臟損傷具有一定的保護作用。
　　 4、仙草水提物具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)血脂和抑制糖尿病大鼠腎組織TGF-β1生成的作用。
　　 5、仙草水提物能有效抑制Cu2+體外誘導的人血清LDL氧化修飾。
　　 6、仙草水提物能明顯抑制OxLDL誘導的大鼠腎系膜細胞TGF