重組人表皮生長(zhǎng)因子PLGA納米粒經(jīng)皮治療大鼠糖尿病潰瘍的作用研究.pdf

1、外傷特別是由燒傷、燙傷等原因引起的大面積皮膚損傷是臨床常見創(chuàng)傷，創(chuàng)面常常難以愈合，且常伴隨著感染、炎癥等問(wèn)題，創(chuàng)面的愈合速率已成為影響此類外傷臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病的發(fā)病率大大提高，患病人數(shù)大量增加，在長(zhǎng)期糖尿病患者中，糖尿病潰瘍是最常見的慢性并發(fā)癥之一，有約15％的糖尿病患者最終可能患上糖尿病潰瘍這種頑固性的皮膚疾病，其病程長(zhǎng)，花費(fèi)大，給患者帶來(lái)了極大的痛苦，是目前臨床上亟待攻克的難題。

2、　　在外傷愈合或破損皮膚修復(fù)的過(guò)程中，表皮生長(zhǎng)因子發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。表皮生長(zhǎng)因子是單鏈多肽，分子量約為6kD，等電點(diǎn)為4.6，在皮膚外傷的愈合過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用，可有效促進(jìn)皮膚的再生和傷口的愈合。通過(guò)基因工程重組方法制備的的重組人表皮生長(zhǎng)因子(recombinant human EpidermalGrowth Factor，rhEGF)與內(nèi)源性的表皮生長(zhǎng)因子在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性上高度一致，因此目前臨床常用基因工程重組的人表皮生

3、長(zhǎng)因子經(jīng)皮給藥作為大面積皮膚損傷或潰瘍的輔助治療藥物。作為基因工程表達(dá)的多肽類藥物，目前rhEGF常用的給藥劑型為溶液劑或噴霧劑，它們具有生物半衰期短，穩(wěn)定性差，易被酶解等缺點(diǎn)，在應(yīng)用方面受到一定的限制。
　　近年來(lái)隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，經(jīng)皮給藥的納米制劑也得到了較多的關(guān)注，納米粒因其所具有的獨(dú)特性能，成為經(jīng)皮給藥的熱點(diǎn)研究方向之一。納米粒可作為藥物的儲(chǔ)庫(kù)，起到緩控釋給藥的作用，還可通過(guò)與皮膚脂質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)納米粒的皮膚透過(guò)

4、率，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，提高了藥物的生物利用度。目前，用于制備納米粒的載體主要分為天然的大分子體系和可降解的高分子聚合物，高分子聚合物因?yàn)榧兌雀?，可選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是唯一被FDA認(rèn)可的可作為藥物輔料的高分子聚合物，其具有良好的生物相容性，可降解性，良好的成膜性和安全性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛的用于納米給藥系統(tǒng)的制備。
　　本課題擬通過(guò)制備得到rhEGF-PLGA納米給藥系統(tǒng)，延長(zhǎng)rhEGF的半

5、衰期，提高其穩(wěn)定性，增強(qiáng)其皮膚透過(guò)率和滯留量，并局部緩慢釋放藥物，同時(shí)利用經(jīng)皮給藥靶向性好的特點(diǎn)，達(dá)到有效提高皮膚內(nèi)rhEGF的濃度并延長(zhǎng)作用時(shí)間的目的。通過(guò)觀察rhEGF-PLGA納米粒的透皮效果，體外促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物活性，以及在外傷和糖尿病皮膚潰瘍動(dòng)物模型中促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的能力，評(píng)價(jià)所構(gòu)建的rhEGF-PLGA納米粒給藥系統(tǒng)的療效，為rhEGF-PLGA納米粒新型經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。
　　首先，我們采用W/O/

6、W復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法制備得到了rhEGF-PLGA納米粒，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)rhEGF-PLGA納米粒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以包封率為指標(biāo)，選擇PLGA使用量(A)，泊洛沙姆F-68的濃度(B)，rhEGF的投藥量(C)，復(fù)乳乳化超聲時(shí)間(D)作為考察因素，建立L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化rhEGF-PLGA納米粒的制備工藝。結(jié)果表明rhEGF-PLGA納米粒的最佳制備工藝為:PLGA使用量為200mg，泊洛沙姆F-68的濃度為1％，rhE

7、GF投藥量為800μl，復(fù)乳化超聲時(shí)間為1min，各個(gè)因素對(duì)rhEGF-PLGA納米粒包封率的影響順序?yàn)锳＞C＞D＞B。按最佳制備工藝制備的rhEGF-PLGA納米粒的平均包封率為(73.99±2.86)％，RSD為3.9％，平均載藥量為（1.16±0.02）％，RSD為1.5％，說(shuō)明該制備工藝具有可靠的穩(wěn)定性。利用透射電鏡、激光粒度散射儀對(duì)制備的rhEGF-PLGA納米粒進(jìn)行表征，制備的rhEGF-PLGA納米粒的平均粒徑為259.4

8、±2.9nm。在pH7.4 PBS緩沖液中對(duì)rhEGF-PLGA納米粒進(jìn)行體外釋藥考察，發(fā)現(xiàn)該納米粒具有緩釋效應(yīng)，其在1h內(nèi)突釋量約為44.04％，24h累積釋藥量約為97.09％。
　　其次，我們利用平行制備的rhEGF-PLGA熒光納米粒進(jìn)行了體外納米粒透皮效果的考察。實(shí)驗(yàn)表明，制備得到的rhEGF-PLGA熒光納米粒具有與rhEGF-PLGA納米粒相似的粒徑和藥物釋放特征。將裸鼠皮膚分為完整皮膚組和去角質(zhì)皮膚組，在透皮擴(kuò)散池

9、中進(jìn)行納米粒透皮實(shí)驗(yàn)，利用熒光顯微鏡觀察熒光納米粒在皮膚中的分布，發(fā)現(xiàn)rhEG-PLGA熒光納米?？捎行高^(guò)皮膚角質(zhì)層，進(jìn)入皮膚真皮層，并且在去角質(zhì)皮膚組中的熒光強(qiáng)度明顯大于完整皮膚中的熒光強(qiáng)度，說(shuō)明在角質(zhì)層受損時(shí)，rhEGF-PLGA納米粒的透皮量大大增加。這個(gè)現(xiàn)象提示了在皮膚潰瘍或外傷等皮膚角質(zhì)層遭到破壞的情況下，rhEGF-PLGA納米?？筛行У臄y帶藥物進(jìn)入活性表皮層，發(fā)揮表皮生長(zhǎng)因子的生物活性，更好的促進(jìn)皮膚潰瘍或外傷的愈合。

10、此外，實(shí)驗(yàn)中我們也觀察到，無(wú)論是在完整皮膚還是在去角質(zhì)層的皮膚中，毛囊均可作為rhEGF-PLGA熒光納米粒進(jìn)入活性表皮層的有效通道。
　　第三，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明了所制備的rhEGF-PLGA納米粒仍然具有較好的EGF生物學(xué)活性，實(shí)驗(yàn)均以對(duì)EGF敏感的小鼠成纖維細(xì)胞Balb/C3T3細(xì)胞為對(duì)象。在劃痕實(shí)驗(yàn)中觀察到rhEGF-PLGA納米?？捎行У拇龠M(jìn)Balb/C3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)，其促進(jìn)3T3細(xì)胞生長(zhǎng)的

11、能力與同濃度的rhEGF溶液相當(dāng)，且隨著rhEGF-PLGA納米粒濃度的加大而增強(qiáng)。CCK8細(xì)胞增殖能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明rhEGF-PLGA納米粒具有良好的促Balb/C3T3細(xì)胞增殖的生物活性，且隨著給藥劑量的增大，rhEGF-PLGA納米粒促進(jìn)Balb/C3T3細(xì)胞增殖的能力隨之增強(qiáng)。有意思的是，在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，rhEGF溶液促進(jìn)Balb/C3T3細(xì)胞增殖的能力逐漸減弱，而rhEGF-PLGA納米粒促進(jìn)Bal

12、b/C3T3細(xì)胞增殖的能力卻逐漸增強(qiáng)，證明了rhEGF-PLGA納米粒具有緩釋效果，可有效延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。
　　最后，我們分別構(gòu)建了家兔外傷模型和糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型，并利用這兩種動(dòng)物模型在體內(nèi)驗(yàn)證了rhEGF-PLGA納米粒經(jīng)皮給藥對(duì)外傷和糖尿病皮膚潰瘍的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水和PLGA空白納米粒相比，rhEGF-PLGA納米粒可加快受損部位皮膚的生長(zhǎng)，有效促進(jìn)外傷和糖尿病潰瘍皮膚的愈合，病理切片檢查結(jié)果表明新

13、長(zhǎng)出的皮膚結(jié)構(gòu)致密、完整，愈合效果顯著優(yōu)于空白對(duì)照組，證明了rhEGF-PLGA納米粒經(jīng)皮給藥對(duì)外傷和糖尿病潰瘍皮膚的愈合均具有良好的治療效果。
　　綜上所述，本研究采用了W/O/W復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法制備得到了rhEGF-PLGA納米粒，通過(guò)工藝優(yōu)化，提高了納米粒的包封率，獲得了制備工藝簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好的rhEGF-PLGA納米粒的制備方法。rhEGF-PLGA納米粒透皮實(shí)驗(yàn)證明該納米?？梢杂行У耐高^(guò)角質(zhì)層，達(dá)到真皮層，在角質(zhì)層受損的