微針導入技術促進重組人表皮生長因子透皮吸收.pdf

1、目的：
　　表皮生長因子（Epidermal Growth Factor,EGF）具有加速皮膚角質(zhì)細胞的遷移、分化和增殖作用，現(xiàn)已廣泛的用于各種化妝品中。然而，由于皮膚的屏障作用，化妝品中的EGF幾乎不能經(jīng)皮滲透進入皮膚。本文旨在研究通過微針技術，提高EGF透皮吸收量，從而發(fā)揮生理和藥理作用，同時也為其他大分子藥物經(jīng)皮滲透提供實用方法。
　　方法:
　　1、剃除SD大鼠背部毛發(fā)后，肉眼觀察剃毛后皮膚出血情況及皮下組織修

2、剪前后情況。取下SD大鼠皮膚后行HE染色，組織學觀察皮下組織修剪前后皮膚角質(zhì)層完整性和修剪層次和微針針刺后的針刺深度。
　　2、采用改良的Franz擴散池進行大鼠離體皮膚滲透試驗，分為5組：生理鹽水組、10.0mg/L rhEGF組、微針+1.0mg/L rhEGF組、微針+10.0mg/L rhEGF組、微針+20.0mg/L rhEGF組。用rhEGF ELISA KIT法測定接受液中EGF的含量，分別計算出在涂藥后的0.5h

3、、1h、2h、4h、6h和8h的藥物累積滲透量和累積滲透率，確認使用微針后rhEGF獲得了良好的滲透效果。
　　3、SD大鼠處理操作：取3只體重約200±30g的大鼠，備皮后飼養(yǎng)24h，腹腔注射水合氯醛（0.003mL·g-1）麻醉。于大鼠脊柱兩側對稱部位畫直徑約1.50cm的圓圈，左右各三個，使用微針陣列以約5N壓力（與人手指按壓力度相當）刺入皮膚。
　　4、龍膽紫染色、大體和組織學觀察：SD大鼠按操作3處理后，用龍膽紫染

4、色，拍攝照相，肉眼觀察并記錄皮膚有無紅斑及水腫出現(xiàn)以及角質(zhì)層恢復情況。切取全層皮膚行HE染色，觀察組織學變化。
　　5、鈣黃綠素染色實驗：大鼠按操作3處理后，用鈣黃綠素棉球覆蓋，避光染色10min，取開棉球，用鹽水和酒精棉球交替擦拭各2遍，取全層皮膚稍微修剪皮下組織后置于載玻片，立即在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長515nm，統(tǒng)計光斑數(shù)，獲取熒光圖像。
　　6、取10只已備皮的SD大鼠，體重約200±30g，

5、分2組，每組5只，按操作3處理。待完全麻醉后進行標記，第一組為10.0mg/L rhEGF組，左側由頭側向尾側標記為0.5h、1h、2h，右側從頭到尾標記為4h、6h、8h，直接皮膚給藥至指定時間點后切取皮膚全層及皮下肉膜均漿。第二組為微針+10.0mg/L rhEGF組，左側由頭側向尾側標記為0.5h、1h、2h，右側從頭到尾標記為4h、6h、8h。微針5N壓力后，立即外用10.0mg/L rhEGF直至指定時間，取涂抹部位皮膚全層，

6、將全層皮膚和皮下肉膜層分開，分別勻漿，采用rhEGF ELISA KIT測定各組皮膚及皮下肉膜rhEGF濃度。
　　7、皮膚和肉膜中EGF含量分別用x±s表示。采用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析。多個實驗組樣本均數(shù)兩兩之間的全面比較用SNK-q檢驗（n=5），P<0.05為差異有顯著性。
　　結果：
　　1、大鼠脊柱兩側毛發(fā)剃除干凈，未見傷痕及出血點，飼養(yǎng)24h后，角質(zhì)層完好無損，皮膚屏障結構健全。修剪后完整

7、保留真皮層，未見皮下肌肉及脂肪組織。微針陣列針刺大鼠皮膚后，角質(zhì)層被破壞，微針刺入深度達真皮淺層。隨著時間推進，大鼠皮膚逐漸愈合，于12h~16h皮膚基本愈合，角質(zhì)層完整性恢復。
　　2、微針+rhEGF組較rhEGF組獲得了良好的透皮效果。在給藥0.5h后生理鹽水組可測得微量EGF，說明鼠皮內(nèi)正常存在EGF。各時間點10.0mg/L rhEGF組、微針+1.0mg/L rhEGF組、微針+10.0mg/L rhEGF組、微針+2

8、0.0mg/L rhEGF組與生理鹽水組比較均可測得rhEGF透過，P<0.05。生理鹽水組、10.0mg/L rhEGF組、微針+1.0mg/L rhEGF組、微針+10.0mg/L rhEGF組、微針+20.0mg/L rhEGF組隨著時間遷移rhEGF較上一時間點透過量增加，P<0.05。微針+10.0mg/L rhEGF組較10.0mg/L rhEGF組獲得了良好的透皮效果，微針+10.0mg/L rhEGF組2h、4h、6h、

9、8h透過量分別為10.0mg/L rhEGF組的9.485、19.989、12.768、6.994倍（P<0.05）。微針+10.0mg/L+rhEGF組、微針+20.0mg/L rhEGF組在2~4h單位時間透皮量和單位時間透皮率達到峰值，各組累積透皮量和累積透皮率隨時間延長緩慢增加。各組8h累積透皮率小于均1％。
　　3、微針針刺后8h仍可見有龍膽紫殘留于角質(zhì)層上，16h后基本不見龍膽紫殘留。推測微孔愈合時間在8~16h。

10、r>　　4、鈣黃綠素染色：微針處理皮膚微孔愈合過程中，鈣黃綠素透過量減少，熒光光斑變小，12h時微弱可見，16h觀察不到熒光光斑。
　　5、創(chuàng)傷愈合組織學觀察：滾輪微針處理后皮膚屏障破壞，深達真皮淺層， 隨著時間的延長，微孔收縮，尺寸變小。到16h，微孔被增生的表皮細胞覆蓋，皮膚屏障結構基本恢復。
　　6、微針+10.0mg/L組及10.0mg/L組在2h、4h、6h、8h皮膚組織中EGF含量較正常皮膚均增加（P＜

11、0.05）。微針+10.0mg/L組及10.0mg/L組在4h后皮膚EGF含量均達到峰值，為正常皮膚的1.92倍（P＞0.05）。
　　7、10.0mg/L rhEGF組、微針+10.0mg/L rhEGF組大部分時間點肉膜EGF含量高于正常皮膚（P＜0.05）。微針+10.0mg/L rhEGF組肉膜各個時間點EGF含量均高于10.0mg/L rhEGF組肉膜（P＜0.05）。
　　結論：
　　1、微針+rhEGF組