含重組人表皮生長(zhǎng)因子（rh-EGF）新型水凝膠的構(gòu)建及其對(duì)糖尿病鼠傷口愈合的影響和機(jī)理探討.pdf

1、研究目的: 1．觀察rh—EGF在水凝膠基質(zhì)中的釋放模式。 2．檢測(cè)rh—EGF在水凝膠基質(zhì)中釋放后的生物活性。 3．探討含rh—EGF水凝膠對(duì)糖尿病大鼠傷口愈合的影響及可能的作用機(jī)理。 材料與方法: 1.構(gòu)建含rh-EGF的水凝膠原料：rh-EGF、聚乙烯醇、海藻酸鈉、甘油、苯甲酸鈉、硼酸鈉、氯化鈣。合成技術(shù)：原位交聯(lián)。物理性能檢測(cè)：由合作單位中山大學(xué)高分子研究所完成。毒理實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組其他成員完

2、成。 2.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中的釋放模式及穩(wěn)定性觀察 3.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中釋放后的活性檢測(cè)(細(xì)胞增殖MTT法)分別取上述實(shí)驗(yàn)2中1 d、7 d、14 d各12個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放液0.4 ml加入3.6 ml含10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含rh-EGFl～10 ng/ml)，用0.22 um濾器過(guò)濾后備用。各取200μl檢測(cè)液加入已接種Balb/c3T3細(xì)胞的96孔板中，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(培養(yǎng)基中含rh-E

3、GF標(biāo)準(zhǔn)品1～64 ng/ml，分別為1 ng/ml、4 ng/ml、16 ng/ml、64 ng/ml，每個(gè)濃度設(shè)3孔)和陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基中不含rh-EGF)各12孔。于37℃5﹪CO<,2>環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)。MTT法于492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)活性(用吸光度表示)。 4.建立糖尿病大鼠皮膚傷口模型56只250～300克清潔級(jí)SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，連續(xù)3 d腹腔內(nèi)注射35 mg/kg STZ誘導(dǎo)糖尿病，注射3 d后尾靜脈

4、采血檢測(cè)隨機(jī)血糖水平，注射后隨機(jī)血糖水平≥16.7 mmol/L，視為糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食、飲水，每周監(jiān)測(cè)體重和血糖，根據(jù)血糖水平皮下注射低精蛋白胰島素(NPH)1-2 U/d，血糖維持在16.7 mmol/L～28 mmol/L。 5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與創(chuàng)面用藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按創(chuàng)面處理因素的不同分4大組，每組按不同處理時(shí)間再分為7天組和14天組(見(jiàn)表1)。空白對(duì)照組：不予處理；水凝膠基質(zhì)組：每天外用水凝膠基質(zhì)0

5、.5g/每個(gè)創(chuàng)面；rh-EGF水凝膠組：每天外用rh-EGF水凝膠0.5 g/每個(gè)創(chuàng)面(含rh-EGF5μg)；rh-EGF水溶液組：每天外用rh-EGF水溶液0.5 ml/每個(gè)創(chuàng)面(含rh-EGF5μg)。 6.傷口愈合率評(píng)價(jià)分別在傷口形成后0 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行傷口拍攝(A610，Canon)，同時(shí)放置一個(gè)有刻度直尺并標(biāo)明大鼠的號(hào)碼。傷口面積用Image J(1.36b版本)進(jìn)行計(jì)算

6、。 7.皮膚組織HE(Haematoxylin and eosin)染色及組織學(xué)評(píng)分組織取材后，經(jīng)4﹪的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行與頭尾軸和皮膚表面垂直厚度4μm切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，然后進(jìn)行濃度下行的梯度酒精直至蒸餾水。蘇木素-伊紅染色，自來(lái)水沖洗。常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。組織切片HE染色后，顯微鏡下觀察以下指標(biāo)并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分：表皮和真皮的再生、肉芽組織厚度、新生血管形成，由一位病理科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分

7、。 8.皮膚組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SABC法染色。切片常規(guī)脫蠟水化后，加入過(guò)氧化酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，抗原修復(fù)后滴加5﹪BSA封閉非特異性反應(yīng)，加入小鼠抗大鼠PCNA的第一抗體，4℃冰箱過(guò)夜(陰性對(duì)照用PBS替代一抗)后加入生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育后再加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，DAB顯色，脫水、透明、封片。染色過(guò)程中均設(shè)有陰性對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果按照IRS標(biāo)準(zhǔn)

8、進(jìn)行評(píng)分。 9.皮膚組織中抗凋亡蛋白(BCL-2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SABC法染色。切片常規(guī)脫蠟水化后，加入過(guò)氧化酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，抗原修復(fù)后滴加5﹪BSA封閉非特異性反應(yīng)，加入兔抗大鼠BCL-2的第一抗體，4℃冰箱過(guò)夜(陰性對(duì)照用PBS替代一抗)后加入生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育后再加入鏈霉菌抗生物素蛋白.過(guò)氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。染色過(guò)程中均設(shè)有陰性對(duì)照。免疫組化染色

9、結(jié)果按照IRS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。 10.皮膚組織中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)蛋白質(zhì)水平的Western blot檢測(cè)提取皮膚組織中總蛋白質(zhì)，用MiniBCA法測(cè)定蛋白濃度，再通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)來(lái)測(cè)定EGFR的蛋白質(zhì)水平，以β-actin作為內(nèi)參照。在暗室中用X光膠片曝光。用BandScan4.3軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，以總灰度代表EGFR蛋白的表達(dá)量，以目的蛋白與β-actin的比值代表目的蛋白相對(duì)水平。

10、 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)測(cè)量資料多組間比較采用多元方差分析，非重復(fù)測(cè)量資料多組間比較采用單因素方差分析，非正態(tài)數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α值定為0.05. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中的釋放模式及穩(wěn)定性觀察試驗(yàn)期間，rh-EGF水凝膠在不同溫度、不同儲(chǔ)存時(shí)間下外觀、性質(zhì)、氣味、pH值均無(wú)明顯變化。

11、 2.rh-EGF在水凝膠基質(zhì)中釋放后的活性檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組的平均活性(吸光度)分別為0.90±0.10、0.86±0.10、0.80±0.14、0.87±0.15、0.55±0.10。實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組促BALB/c3T3增殖的活性均高于陰性對(duì)照組(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.糖尿病大鼠傷口模型的建立SD大鼠腹腔注射STZ 3 d后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)血糖均高于16.7

12、mmol/L，范圍波動(dòng)于17～28 mmol/L。成模后體重均明顯下降。從血糖和體重隨時(shí)間變化的趨勢(shì)看，空白對(duì)照組、水凝膠基質(zhì)組、含rh-EGF水凝膠組、含rh-EGF水溶液組4組組間血糖值、體重值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)期間血糖和體重對(duì)傷口愈合的影響在各組間取得均衡。 4.傷口愈合率比較從傷口愈合率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)看，4組愈合率的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。含rh-EGF水凝膠組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)愈合率均最高。傷口形成后第3

13、d、5 d水凝膠處理組(B、C)愈合率高于空白對(duì)照組(p<0.05)；第10 d水凝膠處理組(B、C)優(yōu)于非水凝膠處理組(A、D)(p<0.05)；第14 d三個(gè)治療組均優(yōu)于空白對(duì)照組(p<0.05)，而三個(gè)治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.4組傷口組織病理學(xué)比較在新生血管形成評(píng)分中，傷口形成后第7 d rh-EGF處理組(C、D)高于非rh-EGF處理組(A、B)(p<0.05)，提示rh-EGF具有促進(jìn)新生血管形成的作用。在再

14、上皮化評(píng)分中，水凝膠處理組(B、C)高于非水凝膠處理組(A、D)，14 d時(shí)趨勢(shì)明顯(p<0.05)，提示水凝膠基質(zhì)可促進(jìn)再上皮化。在上述評(píng)分中，rh-EGF 水凝膠組評(píng)分最高，提示rh-EGF和水凝膠基質(zhì)協(xié)同加速新生血管形成和再上皮化。肉芽組織厚度評(píng)分中，傷口形成后第7 d時(shí)rh-EGF水凝膠組略高于其它三組，組間差異暫未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.不同時(shí)間4組PCNA蛋白表達(dá)水平的比較PCNA蛋白主要在增生活躍的表皮細(xì)胞、毛囊上皮

15、、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的胞核表達(dá)，表達(dá)水平7 d>14 d>0 d。從其隨時(shí)間變化的趨勢(shì)看，各組問(wèn)的區(qū)別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0d時(shí)空白對(duì)照組、水凝膠基質(zhì)組、含rh-EGF水凝膠組、含rh-EGF水溶液組組問(wèn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。傷口形成后第7 d各組表達(dá)水平分別為9.69±0.93、10.80±1.25、11.49±1.12、10.71±1.27：rh-EGF水凝膠組高于空白對(duì)照組(p<0.05)。第14 d各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示

16、rh-EGF水凝膠在傷口愈合的早中期促進(jìn)細(xì)胞增殖。 7.結(jié)果提示rh-EGF在傷口愈合的早中期可能具有上調(diào)BCL-2蛋白表達(dá)的作用，rh-EGF水凝膠可能對(duì)凋亡途徑產(chǎn)生一定的影響，從而影響傷口愈合。 8.不同時(shí)間4組間EGFR蛋白表達(dá)水平的比較從EGFR蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間變化的趨勢(shì)看，結(jié)果提示rh-EGF在傷口愈合的早中期具有上調(diào)EGFR蛋白表達(dá)作用。EGFR蛋白表達(dá)水平的變化規(guī)律與PCNA、BCL-2的變化規(guī)律相近，提

17、示EGFR在傷口愈合過(guò)程中可能同時(shí)參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。 結(jié)論: 1.本研究構(gòu)建的含rh-EGF水凝膠具有儲(chǔ)存穩(wěn)定性。水凝膠基質(zhì)對(duì)rh-EGF有緩釋和保持生物活性作用。 2.水凝膠基質(zhì)、含rh-EGF的水凝膠能促進(jìn)糖尿病大鼠傷口愈合。 3.含rh-EGF的水凝膠促進(jìn)傷口愈合的可能機(jī)制為：水凝膠基質(zhì)保護(hù)創(chuàng)面、促進(jìn)再上皮化；rh-EGF在傷口形成后的早中期上調(diào)內(nèi)源性EGFR表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分