Id1在肝癌中的表達(dá)意義及其與HBx的關(guān)系研究.pdf

1、【背景】原發(fā)性肝癌是成年人最常見的惡性腫瘤之一，其中90％-95％為肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。盡管肝癌的臨床研究已取得較大進(jìn)展，但由于其術(shù)后高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率，治療預(yù)后不佳，每年因肝癌死亡人數(shù)仍高居我國惡性腫瘤致死的第二位。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染已證實(shí)是HCC 發(fā)生的一個主要危險因素。 乙肝病毒X蛋白由HBV-DNA中最短的開放讀取框所編碼，它在HBV 感染和HCC 發(fā)生中起到

2、了重要的作用，且在多數(shù)HCC 患者肝組織和血清中有HBxAg 和抗-HBx 抗體的陽性表達(dá)，它也是HBV 感染和HCC 存在的重要生物標(biāo)志物。HBx 具有催化轉(zhuǎn)錄活性，通過作用于線粒體以及其它因素如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase）和生存素（survivin）等調(diào)節(jié)凋亡，并且參與細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)到通路，如PI-3-K-Akt/PKB，Jak-STAT，RAS-RAF-MAPK瀑式級聯(lián)信號，并影響細(xì)胞周期等。 Id蛋白

3、即分化抑制或DNA 結(jié)合抑制蛋白（Inhibitor of Differentiationand/or DNA binding proteins）是缺少DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的螺旋－環(huán)－螺旋（helix-loop-helix，HLH）蛋白，是HLH 轉(zhuǎn)錄因子的顯性負(fù)性調(diào)節(jié)分子。已知哺乳動物Id 蛋白家族有Id1～I(xiàn)d4 等4 位成員。它們可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞生長、衰老、分化、凋亡和血管生成等。研究表明Id 蛋白特別是Id1，可通過滅

4、活腫瘤抑制因子和激活生長促進(jìn)通路而促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展，并可以正向調(diào)節(jié)腫瘤生長，是腫瘤增殖所必需的關(guān)鍵因子。 Id1可能是預(yù)測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發(fā)生風(fēng)險的有用指標(biāo)，并且可作為治療肝癌的靶向分子。 【目的】（1）檢測Id1 和HBx 在肝癌組織中的表達(dá)情況；（2）分析Id1表達(dá)與肝癌臨床病理特征以及HBx 蛋白表達(dá)之間的關(guān)系；（3）建立兩段不同長度的Id1 啟動子熒光素酶報告基因載體；（4）檢測肝癌

5、HepG2 細(xì)胞中HBx對Id1 啟動子活性的影響。 【方法】（1）收集西京醫(yī)院病理科保存的肝癌、肝轉(zhuǎn)移癌、肝臟血管瘤等病例的石蠟包埋標(biāo)本，切片并收集詳細(xì)的臨床資料；（2）免疫組化方法檢測Id1 和HBx 在肝癌組織和非肝癌肝組織中的表達(dá)情況；（3）結(jié)合臨床資料，統(tǒng)計分析Id1 在肝癌標(biāo)本中表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理特征以及HBx 表達(dá)的關(guān)系。（4）檢索Id1 啟動子序列，設(shè)計兩段不同長度Id1 啟動子的上下游引物；5）以HepG2 細(xì)

6、胞基因組DNA 為模板，克隆Id1 啟動子序列；（6）將啟動子片斷克隆入熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建兩段Id1 啟動子熒光素酶報告基因載體；（7）將測序正確的Id1 熒光素酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系；（8）檢測熒光素酶活性，分析HBx 對兩段Id1 啟動子活性的影響。 【結(jié)果】（1）Id1 和HBx 在肝癌組織中共表達(dá)陽性率為97.9％；（2）肝癌組織中Id1 和的Id1 和HBx 的共表達(dá)強(qiáng)度高于非肝癌組織；（

7、3）肝癌分化程度越低，Id1 和HBx 在肝癌中共表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)；（4）HBV 復(fù)制活躍組和HBV 低復(fù)制感染恢復(fù)階段，的Id1 和HBx 的共表達(dá)情況高于無HBV 感染或有獲得免疫組，但HBV 中度復(fù)制組和無HBV 感染或有獲得免疫組差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義；（5）Id1 和HBx 的表達(dá)水平與血清AFP，血清ALT、AST，血清膽紅素，血凝PT、APTT、INR 和FIB 水平，以及與肝癌體積不相關(guān)。（6）以肝癌HepG2 細(xì)胞DNA為模板

8、，克隆出兩段長度分別為1096bp 的Id1p1和266bp 的Id1p2 的Id1 啟動子；（7）經(jīng)酶切并測序鑒定證實(shí)兩段載體均包含Id1 啟動子序列，表明包含不同長短的Id1 啟動子報告基因載體構(gòu)建成功；（8）經(jīng)熒光照度計測定證實(shí)Id1p1 和Id1p2 均較空載體有更高的轉(zhuǎn)錄活性，兩段均包含核心啟動子部分，且Id1p1 顯示出更高的啟動子活性。 【結(jié)論】（1）肝癌組織中Id1 和HBx 有共同的表達(dá)，且肝癌組織中Id1和H