Id1在乳腺癌中的表達及其基因沉默效果的研究.pdf

1、Id1蛋白是DNA結(jié)合/分化抑制因子(Inhibitor of DNA binding/differentiation，Id)家族(包括Id1，Id2，Id3，Id4)蛋白的一種，從屬于HLH轉(zhuǎn)錄因子家族，其編碼蛋白缺乏DNA結(jié)合必需的堿性氨基酸序列，與bHLH結(jié)合成異二聚體(Id-bHLH)后，抑制bHLH與DNA及其他組織特異性bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子是目前已知的體內(nèi)重要的一大類轉(zhuǎn)錄因子家族，參與細(xì)胞命運和細(xì)胞分化過

2、程的基因調(diào)控。Id1通過這種負(fù)顯性調(diào)控作用抑制了bHLH轉(zhuǎn)錄因子對下游分子的激活作用，調(diào)控細(xì)胞的命運及分化過程。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，Id1蛋白在正常細(xì)胞發(fā)育中隨細(xì)胞分化逐漸降低，在分化終末時極少表達或不表達，但在多種來源的腫瘤組織中高表達，顯示Id1具備癌基因的特性。1999年，美國學(xué)者LydenD在Nature雜志上發(fā)表文章，認(rèn)為Id1和Id3是新生血管包括腫瘤新生血管生成的必要因素，此后Id1基因與腫瘤關(guān)系的研究成為新的熱點，

3、Id1蛋白在多種腫瘤組織中的高表達被相繼報道。在某些惡性腫瘤中，Id1的表達程度與腫瘤組織的惡性度、侵襲性或新生血管形成及預(yù)后等呈正相關(guān)，表明Id1在某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。由于Id1與某些腫瘤的生長侵襲特性密切相關(guān)，因而Id1蛋白檢測對于評判某些腫瘤的進展和預(yù)后具有極高的研究價值，而針對Id1蛋白的靶向治療設(shè)計也受到特別關(guān)注并已開始相關(guān)的實驗研究。
　　 國內(nèi)近兩年在肺癌、肝癌、胃癌、腎癌中相繼報道了Id1的表達，

4、在乳腺癌研究中報道較少。從開展乳腺癌根治術(shù)到今天的綜合治療，經(jīng)歷了100多年，雖然診斷水平和治療效果不斷提高，但是乳腺癌的發(fā)病率仍位于女性惡性腫瘤的首位，且病死率居高不下，嚴(yán)重的威脅著女性的健康。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的基因治療研究取得了很大進展，有望成為乳腺癌治療的新途徑。故本研究以乳腺癌為研究對象，研究乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞中Id1的表達及其意義，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞Id1基因表達，探討抑制Id1基因表達的抗癌

5、效果，旨在為以Id1為靶點從事基因治療乳腺癌提供臨床及實驗依據(jù)。
　　 第一部分 Id1在乳腺癌組織中的表達及其與臨床生物學(xué)關(guān)系的研究
　　 目的：探討乳腺癌組織中Id1的表達及意義。
　　 方法：采用免疫組化S-P法檢測正常乳腺組織、浸潤性導(dǎo)管癌組織中Id1的表達，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　 結(jié)果：Id1在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達率為18.07±11.10％，較正常乳腺組織中(1.39±

6、1.57％)顯著性增高(P＜0.01)。Id1在Ⅰ、Ⅱ級浸潤性導(dǎo)管癌中表達率為12.55±5.12％和16.46±8.88％，顯著低于Ⅲ級(37.61±6.84％)(P＜0.01)。Id1在50歲以上組與小于50歲組表達率為21.17±12.71％和15.52±9.00％，腫瘤最大徑2cm以上與小于2cm組為18.16±11.53％和17.33±10.50％，腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組為21.86±11.97％和16.57±10.51％，

7、表達率比較差異均無顯著性(P＞0.05)。Id1在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達與ER、PR表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.529，P＜0.01;r=-0.483，P＜0.01)，而與C-erbB-2表達程度無相關(guān)性（r=0.129，P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1 Id1在正常乳腺組織中無表達或微弱表達，在乳腺癌組織中高表達，并與病理組織學(xué)分級相關(guān)，病理組織學(xué)分級越高、臨床惡性程度高的乳腺癌Id1的表達越高，提示：Id1的表

8、達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，是乳腺癌的重要腫瘤標(biāo)志物。
　　 2 Id1的表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　 3 Id1的表達與ER、PR表達呈負(fù)相關(guān)，提示其高表達在浸潤性導(dǎo)管癌激素依賴型轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌に匾蕾囆椭衅鹱饔?；Id1的表達與C-erbB-2表達無相關(guān)性。
　　 第二部分 Id1在人乳腺癌細(xì)胞株中的表達及沉默Id1的表達對其生長、增殖及凋亡的影響
　　 實驗一 Id1在人乳腺癌細(xì)胞株中的表

9、達
　　 目的：檢測Id1在三種乳腺癌細(xì)胞株中的表達，探討其在不同侵襲轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞株中差異表達的意義。
　　 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western blot技術(shù)檢測三種人乳腺癌MCF-7（雌激素受體陽性、低侵襲性）、MDA-MB-468（雌激素受體陰性、低侵襲性）MDA-MB-231（雌激素受體陰性、高侵襲轉(zhuǎn)移性）細(xì)胞株中Id1mRNA和蛋白的表達，分析其對乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

10、r>　　 結(jié)果：Id1mRNA在三種乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231中均呈陽性表達，Id1mRNA相對表達量分別為0.193±0.078、0.180±0.072、0.499±0.058;Id1蛋白相對表達量分別為0.186±0.073、0.504±0.092、1.293±0.111。Id1蛋白相對表達量在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株中最高，MDA-MB-468細(xì)胞株中次之，MCF-7中最低。Id1

11、表達程度隨細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強而升高，在分化程度低、ER陰性的乳腺癌細(xì)胞株高于分化程度較好的ER陽性細(xì)胞株。
　　 結(jié)論：
　　 1 Id1 mRNA和蛋白在三種乳腺癌細(xì)胞株中均呈陽性表達，說明Id1與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，是乳腺癌的重要腫瘤標(biāo)志物
　　 2 Id1 mRNA和蛋白在不同侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞株中差異明顯，其表達程度隨著侵襲能力的增強而升高。說明Id1是影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要因子。

12、　　 3 Id1蛋白的表達在雌激素受體陰性細(xì)胞株中顯著高于雌激素受體陽性細(xì)胞株，提示：Id1蛋白表達是影響乳腺癌雌激素受體表達的重要因素。
　　 4人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株中的Id1 mRNA和蛋白水平表達最高，是以Id1為靶點從事基因沉默治療乳腺癌的研究的理想細(xì)胞株。
　　 實驗二 Id1-RNAi重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與鑒定
　　 目的：應(yīng)用Id1的siRNA表達載體，轉(zhuǎn)染高表達Id1的人乳腺MDAM

13、B-231細(xì)胞，鑒定篩選抑制效率高的Id1RNAi重組質(zhì)粒，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。
　　 方法：應(yīng)用針對Id1基因編碼的Id1特異性siRNA載體質(zhì)粒Id1-RNAi-1、Id1-RNAi-2、Id1-RNAi-3，體外瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞，RT-PCR和Westem blot方法檢測3種重組質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Id1mRNA和蛋白的表達，并比較其干擾效果。篩選作用干擾效果好的Id1-siRNA載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人乳腺癌

14、MDA-MB-231細(xì)胞，并篩選擴增陽性細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　 結(jié)果：Id1-siRNA載體質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MD-MB-231人乳腺癌細(xì)胞后，RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染3種重組質(zhì)粒后MDA-MB-231細(xì)胞中Id1表達水平均顯著降低：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Id1mRNA(相對表達量分別為0.288±0.094、0.547±0.090、0.511±0.087)比空染組及對照組（分別為0.979±0.112，1.

15、007±0.122)顯著降低(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Id1蛋白(相對表達量分別為0.111±0.108、0.386±0.116、0.628±0.121)比空染組及對照組(1.605±0.113、1.704±0.124)顯著性低(P＜0.01)。其中以轉(zhuǎn)染Id1-RNAi-1的細(xì)胞Id1表達水平降低最為明顯（降低幅度約93％），轉(zhuǎn)染另外兩種重組質(zhì)粒的細(xì)胞中Id1的表達水平下降相對較少，表明針對Id1的siRNA載體轉(zhuǎn)染后Id1基因表

16、達沉默，并以Id1-RNAi-1重組質(zhì)粒沉默Id1效果最好。
　　 結(jié)論：三種Id1-RNAi重組質(zhì)粒，不同程度抑制乳腺癌細(xì)胞的Id1基因的mRNA和蛋白表達水平表達，以Id1-RNAi-1重組質(zhì)粒的基因沉默效果最理想（Id1mRNA和蛋白表達降低幅度約93％），通過鑒定優(yōu)選Id1-RNAi-1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，并篩選擴增陽性細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，為后續(xù)實驗作準(zhǔn)備。
　　 實驗三沉默Id

17、1的表達對人乳腺癌細(xì)胞生長、增殖及凋亡的影響
　　 目的：觀察Id1-RNAi/Id1的基因沉默后的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為變化，檢測凋亡相關(guān)的基因Bax、Bcl-2、Survivin mRNA的變化，進一步深入研究Id1基因沉默對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變及引起凋亡的機制。
　　 方法：采用MTT法檢測Id1-RNAi/MDA-MB-231細(xì)胞增殖、生長情況；克隆形成實驗觀察Id1-RNAi/MDA-M

18、B-231的克隆能力；流式細(xì)胞儀檢測Id1RNAi對乳腺癌細(xì)胞周期和凋亡率的影響；RT-PCR檢測Id1-RNAi/MDA-MB-231細(xì)胞Bax、Survivin、Bcl-2的mRNA水平變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 MTT法檢測Id1-RNAi/MDA-MB-231細(xì)胞與對照組比較，生長速度減慢、倍增時間延長。
　　 2克隆形成實驗觀察到Id1-RNAi/MDA-MB-231細(xì)胞與對照組比較形成克隆數(shù)明顯減

19、少。
　　 3流式細(xì)胞儀檢測Id1RNAi細(xì)胞與對照細(xì)胞周期的構(gòu)成比分別為，G0/G1期：69.8±5.4％和42.6±2.3％;S期：21.6±1.8％和28.4±1.2％；G2/M期：9.6±1.45％和29±2.6％。對應(yīng)比較差異均有顯著性(P＜0.05)。Id1RNAi細(xì)胞與對照細(xì)胞的凋亡百分率分別為（14.58±2.34）％和（3.68±0.18）％，凋亡率顯著性升高（P＜0.05）。
　　 4 RT-PCR檢

20、測Bax mRNA的表達在Id1-RNAi乳腺癌細(xì)胞和對照組中的相對表達量分別為0.64±0.08和0.24±0.05;Bcl-2mRNA相對表達量在Id1-RNAi乳腺癌細(xì)胞和對照組中分別為0.38±0.08和0.54±0.09;Survivin-mRNA相對表達量在Id1-RNAi乳腺癌細(xì)胞和對照組中分別為0.76±0.15和0.89±0.10，差異均有有顯著性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：Id1的基因表達被沉默后，乳腺癌

21、細(xì)胞周期被抑制，細(xì)胞增殖環(huán)節(jié)被阻滯，起到了對乳腺腫瘤生長的抑制作用。沉默Id1后通過提升BaxmRNA表達，下調(diào)Bcl-2mRNA，并引發(fā)了Survivin mRNA表達的相應(yīng)沉默效應(yīng)，使細(xì)胞凋亡顯著增加。RNA干擾技術(shù)使Id1基因沉默達到了治療乳腺癌的顯著效果。
　　 第三部分 Id1基因沉默的乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)生長及侵襲能力的研究
　　 目的：觀察Id1RNAi/MDA-MB-231細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性，及形成瘤生長

22、情況；檢測裸鼠體內(nèi)的形成瘤凋亡、VEGF及MMP-9蛋白表達的表達；研究在裸鼠體內(nèi)Id1基因沉默的抗癌效果。
　　 方法：將Id1-RNAi轉(zhuǎn)染組和對照組的MDA-MB-231細(xì)胞分別接種于裸鼠左背部皮下。觀察兩組的成瘤及生長情況，繪制腫瘤生長曲線；流式細(xì)胞儀檢測移植瘤組織中細(xì)胞凋亡變化；檢測并分析裸鼠移植瘤組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 接種Id1-RNAi轉(zhuǎn)染組較接種MDA

23、-MB-231細(xì)胞組的腫瘤生長速度減慢，腫瘤體積小。
　　 2 流式細(xì)胞儀檢測Id1RNAi組與對照組細(xì)胞的凋亡率分別為19.58±2.34％和8.24±0.86％，接種Id1RNAi組細(xì)胞凋亡率顯著性升高(P＜0.01)。
　　 3 轉(zhuǎn)染組成瘤組織中VEGF和MMP-9蛋白的表達率分別為0.208±0.137和1.350±0.141，較對照組（1.619±0.244和2.031±0.032）顯著性降低(P＜0.01)。